銅藍(lán)蛋白（Cp）含量測試 氧化與抗氧化

本品用于科研實(shí)驗(yàn),不用于臨床。

生化試劑盒可以檢測的樣本類型有哪些?

 生化試劑盒的實(shí)驗(yàn)原理是基于化學(xué)反應(yīng),理論上是不受生物種屬及樣本類型的限制。生化試劑盒樣本檢測通常只分樣本類型,不分種屬。但是某些指標(biāo)在不同種屬或類型樣本中的提取方式不同。因此,具體情況請參見說明書或與技術(shù)支持聯(lián)系確認(rèn)。

生化試劑盒樣本檢測的一般要求:

1)于生化檢測而言,樣本無溶血、脂血、的現(xiàn)象。組織樣本需將血液洗凈擦干后再進(jìn)行稱重處理。

2)樣本處理后盡快進(jìn)行檢測,且保存于冰盒之上,待測。

求

3)樣本需澄清,若不澄清,需離心后取上清進(jìn)行檢測(特殊指標(biāo)除外)。

4)樣本值應(yīng)在試劑盒線性范圍內(nèi),若超過線性范圍,需稀釋后再進(jìn)行檢測,若低于檢測范圍,需增加樣本濃度后進(jìn)行檢測。

微量法和分光光度法的區(qū)別?

分光光度法:主流測定體系為1mL,測試儀器分光光度計(jì),能夠大限度地滿足絕大多數(shù)用戶的需要。

微量法:主流測定體系為0.2mL,測試儀器或分光光度計(jì),測定更加簡便快捷。

試劑盒規(guī)格中是100管和50管是什么意思?

(1)50管/48樣:50管指能夠做50次測定,48樣指可以測試48個樣品。如果每個樣品重復(fù)測定3次,那么只能測定16個樣品。其中有2次測定用于

空白管或者對照管。值得特別注意的是,50管/24樣中由于每個樣品測定都需要做對照,因此能夠測定樣品的數(shù)量僅為8個(假設(shè)做3次重復(fù))

(2)100管/96樣:100管指能夠做100次測定,96樣指可以測定96個樣品,如果每個樣品重復(fù)測定3次,那么只能測定32個樣品。其中有4次測定用

于空白管或者對照管。注意由于瓶璧和移液器吸附等,通常要比理論測定次數(shù)少1~3次。其它規(guī)格的含義依次類推。值得特別注意的是,100

管/48樣中由于每個樣品測定都需要做對照,因此能夠測定樣品的數(shù)量僅為16個(假設(shè)做3次重復(fù))。

如何防止試劑盒失效?

   不要過早訂購,以免試劑盒失效.收到試劑盒后,檢查外包裝是否正常。馬上打開,按照試劑盒說明書核對試劑數(shù)量是否正確,注意瓶中試劑狀態(tài)是否與說明書一致。如果有問題,或者懷疑,馬上聯(lián)系公司銷售,進(jìn)行確認(rèn)。如果沒有問題,請務(wù)必按照說明書進(jìn)行試劑的保存。注意,不同試劑,可能需要分別保存在常溫(25°℃)、4℃和-20℃,務(wù)必分別按照要求保存,不要整個試劑盒放置于冰箱。

如何進(jìn)行預(yù)測定?

(1)務(wù)必在7個工作日內(nèi)進(jìn)行預(yù)測定,以確定該試劑盒是否適合您的樣品,以免造成試劑盒和樣品的浪費(fèi)。

(2)選擇2~3個預(yù)期差異比較大的樣品,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作,注意儀器工作狀態(tài),操作規(guī)范,控制好測定條件,尤其是溫度。

(3)如實(shí)與公司銷售溝通預(yù)測定結(jié)果,公司技術(shù)人員會確認(rèn)測定結(jié)果是否正常,是否需要調(diào)整,如何進(jìn)行調(diào)整,從而確保您的測定結(jié)果可靠。

熒 光 分 析 法

       熒光分析法是指利用某些物質(zhì)被紫外光照射后處于激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子經(jīng)歷一個碰撞及發(fā)射的去激發(fā)過程所發(fā)生的能反映出該物質(zhì)特性的熒光，可以進(jìn)行定性或定量分析的方法。由于有些物質(zhì)本身不發(fā)射熒光（或熒光很弱），這就需要把不發(fā)射熒光的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成能發(fā)射熒光的物質(zhì)。例如用某些試劑（如熒光染料），使其與不發(fā)射熒光的物質(zhì)生成絡(luò)合物，各種絡(luò)合物能發(fā)射熒光，再進(jìn)行測定。因此熒光試劑的使用，對一些原來不發(fā)熒光的無機(jī)物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行熒光分析打開了大門，擴(kuò)展了分析的范圍。

比色皿有哪些規(guī)格?

(1)常量比色皿,如1mL和3mL等,常量法試劑盒都是選用1mL體系,只能用1mL比色皿,不可以用更大體積的比色皿,否則試劑量不夠,無法正常比色。

(2)微量比色皿,如0.25mL和0.5mL等,微量法試劑盒都是選用0.25mL比色皿。一般客戶都選擇使用標(biāo)儀(需要自備酶標(biāo)板)

(3)紫外波長檢測需要石英比色皿,不可以用普通玻璃比色皿。

(4)不同規(guī)格的比色皿,其外觀大小是一致的,都是1cm光徑(也有0.5cm光徑的比色皿,不常見,也可以用,但是計(jì)算時要注意修改計(jì)算公式),其內(nèi)

容積差異在于壁的厚度。

代測的優(yōu)點(diǎn)

(1)更加省事兒,不必為測定犯難。用戶只要提供樣品和想測定的指標(biāo),就不再需要為測定操心了,不再受到操作技能、儀器設(shè)備和時間

的限制,就等著拿到數(shù)據(jù)寫論文。

(2)測定數(shù)據(jù)更有保障。嚴(yán)格的測定質(zhì)量管理體系,從而保證了測定結(jié)果的真實(shí)可靠。我們還建立了定制度。

(3)防止樣品損失無論是用戶自己完成測定全過程,還是購買試劑盒完成測定,都可能因?yàn)槿狈y定經(jīng)驗(yàn),導(dǎo)致測定失敗,從而損失樣品的情況。對于生命科學(xué)研究而言,樣品是最珍貴的。樣品一旦損失,輕則造成研究進(jìn)度被耽擱,重則造成研究失敗!代測能夠充分保證測定成功,從而防止了樣品損失。當(dāng)然,樣品質(zhì)量是測定成功的前提,而且樣品質(zhì)量只有用戶自己才能控制和保證。

生化檢測試劑盒的基本原理

 生化檢測試劑盒,又稱生化試劑盒,是利用特定的生物成分、動力學(xué)及化學(xué)反應(yīng)等技術(shù)制備的試劑盒,用于檢測生理學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域中特定的生物分子或化學(xué)物質(zhì)。生化檢測試劑盒包括底物、酶試劑盒、探針等多個組成部分,其中的是底物-酶法。

底物-酶法是生化檢測試劑盒檢測的基本原理。在該過程中,底物與酶在細(xì)胞膜上結(jié)合形成基質(zhì)酶,進(jìn)而形成底物-酶復(fù)合物。隨著時間的推

移,底物-酶復(fù)合物逐漸分解,釋放出分子小的底物和分子大的未消化的底物。未消化的底物可以被一系列的酶代謝,同時底物、酶和代謝產(chǎn)物都會對復(fù)合物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,從而影響檢測試劑盒的檢測結(jié)果。

生化試劑盒可以檢測的樣本類型有哪些?

  生化試劑盒的實(shí)驗(yàn)原理是基于化學(xué)反應(yīng),理論上是不受生物種屬及樣本類型的限制。生化試劑盒樣本檢測通常只分樣本類型,不分種屬。但是某些指標(biāo)在不同種屬或類型樣本中的提取方式不同。因此,具體情況請參見說明書或與技術(shù)支持聯(lián)系確認(rèn)。

生化試劑盒樣本檢測的一般要求:

1)于生化檢測而言,樣本最-好無溶血、脂血、黃-疸的現(xiàn)象。組織樣本需將血液洗凈擦干后再進(jìn)行稱重處理。

2)樣本處理后最-好盡快進(jìn)行檢測,且保存于冰盒之上,待測。

3)樣本需澄清,若不澄清,需離心后取上清進(jìn)行檢測(特殊指標(biāo)除外)。

4)樣本值應(yīng)在試劑盒線性范圍內(nèi),若超過線性范圍,需稀釋后再進(jìn)行檢測,若低于檢測范圍,需增加樣本濃度后進(jìn)行檢測。

微 量 分 析 法  

      微量分析(Microanalysis)在化學(xué)分析中，其試樣重量為1-10mg的化學(xué)分析方法稱為微量分析。有微量定性分析和微量定量分析之分，定性常采用點(diǎn)滴反應(yīng)和顯微結(jié)晶反應(yīng)等靈敏度較高的分析方法，定量分析常用重量、容量及儀器等分析方法。在以試樣重量不同的分析分類中還有半微量分析和超微量分析等。

微 量 和 超 微 量 分 析

       微量、超微量分析和常量分析主要的差別是取樣的不同。一般稱樣在0.01克~0.001克者為微量分析，小于0.001克者為超微量分析。正因?yàn)闃悠泛苌伲栽诜治霾僮魃弦埠统Ａ糠治龊懿幌嗤?。例如沉淀物的溶解度、指示劑的誤差等對常量分析的影響可以忽略，而在微量和超微量分析時就會引起很大的誤差。尤其是超微量分析要求更嚴(yán)格，須考慮到溶液本身在空氣中的蒸發(fā)，因此在進(jìn)行滴定時必緩在潮濕的空氣中進(jìn)行。

       一般微量分析用的器皿都很小，按其要求的不同有各種不同的形狀。各種儀器分析法經(jīng)過適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)后，可以直接應(yīng)用在微量分析上。

超微量分析由于樣品太少，因此必須在顯微鏡下進(jìn)行所有的分析操作(如沉淀和濡定等)，某些儀器分析(如電位滴定，電解和電導(dǎo)等)，也可用來作為超微量分析之用。

       微量分析在研究工作中用得極廣。尤其是在進(jìn)行稀有元素化學(xué)研究時，在解決地球化學(xué)同題，研究某些稀有元素礦物粗成及其分配規(guī)律時，往往只能得到極少的樣品，在這選種情況下一般的常量分析法是無法進(jìn)行分析的，只有靠微量分析法來解決。另外，在生物化學(xué)中微量分析的應(yīng)用更是普遍

銅藍(lán)蛋白（Cp）含量測試 氧化與抗氧化

本品用于科研實(shí)驗(yàn),不用于臨床。

測定意義:

輔酶NAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要?dú)涫荏w,生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧,在合成 ATP 的同時,形成大量的 ROS,同時 NADH 再生為 NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評價糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)及 NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過氧化狀態(tài)。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循環(huán)。另外,NAD+降解產(chǎn)物對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測定原理:

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD+和 NADH,NADH 通過 PMS 的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT)為甲瓚,在 570nm 下檢測吸光值;而 NAD+可被乙醇脫氫酶還原為 NADH,進(jìn)一步采用 MTT 還原法檢測。

需自備的儀器和用品:

酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

酸性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

堿性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

試劑一:液體 10 mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:液體 3 mL×1 瓶,4℃保存;

試劑三:粉劑×1 瓶,-20 ℃保存,用時加入 3mL 蒸餾水,混勻,用不完的試劑 4℃保存一周;

試劑四:粉劑×1 瓶,4 ℃保存,用時加入 3mL 蒸餾水,混勻,用不完的試劑 4℃保存一周;

試劑五:液體 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存;

試劑六:液體 30mL×1 瓶,4 ℃保存;

試劑七:液體 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NAD+和 NADH 的提取:

1 血清(漿)中 NAD+和 NADH 的提取:

NAD+的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1mL 血清(漿),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADH 的提取:按照血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1mL血清(漿),加入 1mL 堿性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2 組織中 NAD+和 NADH 的提取:

NAD+的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加入 1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADH 的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加入 1mL堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+和 NADH 的提取:

NAD+的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個):酸性提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 酸性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心

10min,取上清,置冰上待測。NADH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個):堿性提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 堿性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。

充分混勻,靜置 5min 后,20000g,25℃離心 5min,棄上清,沉淀中加入:

混勻,取 200μL 轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下讀取對照吸光值 A1 和測定管吸光值 A2,計(jì)算△A=A2-A1。

注意事項(xiàng):

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別:對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若 NAD+測定中△A(A2-A1)≤0.0302,NADH 測定中△A(A2-A1)≤0.0222,說明樣本中輔酶含量較低,已低于檢測限,可做如下調(diào)整:(1)將測定管避光靜置時間 20min 延長到 60min;(2)在提取階段增加取樣量,即取 0.2g 樣本或 0.2mL 樣本加入 1mL 提取液。

5、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管,本試劑盒 100 管保證測 48 個 NAD+或 NADH.

NAD+和 NADH 含量的計(jì)算:

(一) NAD+含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.1475x + 0.0302,R2 = 0.9978;其中 y 為△A,x 為 NAD+濃度 nmol/mL

1、血清(漿)中 NAD+含量計(jì)算

NAD+含量(nmol/mL)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NAD+(nmol/mg prot)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NAD+(nmol/g 鮮重)= [(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NAD+(nmol/104 cell)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302)

(二)NADH 含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.1404x + 0.0222,R2 = 0.9976;其中 y 為△A,x 為 NADH 濃度 nmol/mL

1、血清(漿)中 NADH 含量計(jì)算

NADH 含量(nmol/mL)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADH (nmol/g 鮮重)=[(△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

注 意: 檢測限為 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot