海藻糖酶（Trehalase，THL）試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

THL（EC 3.2.1.28）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中。海藻糖酶主要功能在于生物體分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供應(yīng)。

測定原理：

THL 催化海藻糖產(chǎn)生葡萄糖，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過氧化氫； 過氧化物酶催化過氧化氫氧化 4-氨基偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在 505 nm 有特征吸收峰，以此反映 THL 活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 10ml×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 10ml×1 瓶，4℃保存；（若出現(xiàn)結(jié)冰現(xiàn)象，可 37℃水浴溶解后使用）

樣品測定的準備：

1、細菌或細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量

（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30次）；8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g組織，加入 1mL 提取液），冰浴中勻漿。8000g  ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議取 0.1mL 血清（漿）加入 1mL 提取液），冰浴中勻漿。8000g  ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、 分光光度計或酶標儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 505nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。

3、 工作液的配制：使用前將試劑二和試劑三 1:1 等體積混合，用多少配多少。

4、加樣表：

45℃水浴，準確反應(yīng) 15min，95℃水浴 5 分鐘終止反應(yīng)，得混合液(若出現(xiàn)沉淀可 10000g

4℃離心 10min 后取上清)。

混勻，置 37℃（哺乳動物）或 25'C（其它物種）保溫 15min 后，于 505nm 波長處讀取吸光度。計算 ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。

THL 活力計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸方程為 y = 0.4858x - 0.0042，R2 = 0.9999；x 為標準品濃度（μmol/mL），

y 為吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000

=366× (ΔA+0.0042) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=366×(ΔA+0.0042)÷W

4、按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/10⁴ cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=0.732×(ΔA+0.0042)

5、按血清（漿）體積計算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(V 液 ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=3660×(ΔA+0.0042)

V 樣：加入樣本體積：0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.08mL；V 液：加入血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W： 樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬；T：反應(yīng)時間，15min；

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸方程為 y = 0.2429x - 0.0042，R2 = 0.9999；x 為標準品濃度（μmol/mL），

y 為吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000

=732× (ΔA+0.0042) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=732×(ΔA+0.0042)÷W

4、按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/10⁴ cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反總÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=1.464×(ΔA+0.0042)

5、按血清（漿）體積計算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反總÷(V 液 ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000

=7320×(ΔA+0.0042)

V 樣：加入樣本體積：0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.08mL；V 液：加入血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W： 樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬；T：反應(yīng)時間，15min；

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