查找:NADH氧化酶(NOX)測(cè)試盒100管/96樣

注    意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義: 

NOX(EC 1.6.99.3)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,可在氧氣存在下,直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生,而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
測(cè)定原理:

NOX能夠?qū)ADH氧化為NAD,NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍(lán)(DCPIP)的還原相偶聯(lián),藍(lán)色的DCPIP被還原為無(wú)色的DCPIP,在600nm下測(cè)定藍(lán)色DCPIP的還原速率計(jì)算出NADH氧化酶活性的大小。
需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水
試劑的組成和配制:

試劑一:液體50mL×1瓶,-20℃保存。

試劑二:液體10mL×1瓶,-20℃保存。

試劑三:液體1mL×1瓶,-20℃保存。

試劑四:液體50mL×1瓶,4℃保存。

試劑五:液體6 mL×1瓶,4℃保存。

試劑六:粉劑×2瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入5mL蒸餾水;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g,4℃離心5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的NOX(此步可選做)。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于NOX活性測(cè)定。血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

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測(cè)定步驟:

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測(cè)定

(1)試劑四、試劑五和試劑六于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)孵育5min。

(2)在1mL石英比色皿中加入40μL樣本、700μL試劑四、100μL試劑五和160μL試劑六,混勻,記錄600nm處20s時(shí)吸光值A(chǔ)1和 1min20s后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2。

NOX活力單位的計(jì)算

1、血清(漿)NOX活力的計(jì)算:

單位的定義:每mL血清(漿)在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX(U/mL)=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NOX活力的計(jì)算:

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX(U/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,1mL; V樣:加入樣本體積,0.04mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。