猴角化細(xì)胞內(nèi)分泌因子(KAF)酶聯(lián)免疫試劑盒

試劑盒性能：

1. 檢測范圍：1.95 nmol/L –100 nmol/L。

2. 靈敏度：檢測濃度小于0.78 nmol/L。

3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。

實(shí)驗(yàn)原理

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種常用的免疫學(xué)檢測技術(shù)，其基本原理是利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過酶促反應(yīng)放大信號，檢測微量的蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)。ELISA實(shí)驗(yàn)中所需的試劑和耗材需滿足一定的質(zhì)量要求，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。計(jì)算濃度時，稀釋了“N"倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N"。 

   標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。 如配制150 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。 

   生物su標(biāo)記抗體的稀釋原則：臨用前以生物su標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物su標(biāo)記抗體加990μl生物su標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。 

   辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。 

猴角化細(xì)胞內(nèi)分泌因子(KAF)酶聯(lián)免疫試劑盒

什么時候進(jìn)行ELISA測試時需要準(zhǔn)備一系列稀釋樣本?

1)未知樣本濃度:當(dāng)你不知道樣本中抗原或抗體的濃度時，準(zhǔn)備一系列稀釋樣

可以幫助確保至少有一些稀釋度落在ELISA的線性檢測范圍內(nèi)。

2)避免信號飽和:對于濃度較高的樣本，稀釋可以防止信號飽和，即吸光度值超

出光度計(jì)的最大讀數(shù)，從而確保結(jié)果的線性和準(zhǔn)確性。

3)減少高劑量掛鉤效應(yīng):在某些情況下，過高的抗原濃度會導(dǎo)致檢測抗體無法形

成“夾心"結(jié)構(gòu)，反而降低了檢測信號，這稱為“掛鉤效應(yīng)"。稀釋樣本可以避免這一

現(xiàn)象。

4)優(yōu)化檢測條件:為了找到最佳的檢測條件和稀釋度，初步實(shí)驗(yàn)通常會涵蓋廣泛

的稀釋范圍，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以直接使用最佳稀釋度。

5)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:對于定量ELISA，需要使用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來建立標(biāo)準(zhǔn)

曲線，未知樣本的結(jié)果將與此曲線比較以確定其濃度。

6)控制非特異性結(jié)合:稀釋樣本可以減少非特異性結(jié)合，這種結(jié)合可能在高濃度

樣本中更為常見。

7)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和可比性:為了確保實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可比性，對于不同時間點(diǎn)或不

同實(shí)驗(yàn)條件下的樣本，通常需要準(zhǔn)備相同的稀釋系列。

8)特殊樣本類型處理:某些樣本類型(如血清、血漿或含有抑制劑的樣本)可能

需要稀釋以減少背景干擾或抑制劑的影響。

操作步驟：

1. 加樣：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl。注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果樣品濃度過高，可以用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物su標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物su標(biāo)記抗體加99μl生物su標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

3. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物su標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

5. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

6. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

結(jié)果分析

根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對應(yīng)的OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品的濃度。一般采用擬合曲線法或直線回歸法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過計(jì)算得到待測樣品的濃度。

試劑盒會出現(xiàn)的問題及解決辦法：

1. 加入反應(yīng)終止液后，沒有吸光值或吸光值偏低。

a.原因：未加入酶標(biāo)記物。

解決辦法：請按照操作步驟進(jìn)行。

b.原因：試劑盒內(nèi)容物未能充分回。

解決辦法：確定試劑盒內(nèi)容物回溫后再進(jìn)行操作。

c.原因：室溫太低。

解決辦法：若室溫太低(<19℃)，請于操作步驟4，適當(dāng)延長溫育時間。

d.原因：未使用試劑盒的清洗液清洗。

解決辦法： 請用試劑盒內(nèi)所提供的清洗液清洗。

e.原因：試劑盒已過有效期限。

解決辦法：請更換成仍在有效期限內(nèi)的試劑盒。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不佳，或是平行性不好。

a.原因：溫育位置避光不好或受到氣流干擾。

解決辦法： 請確認(rèn)溫育位置既不透光也不透風(fēng)(如抽屜內(nèi))。

b.原因：操作時間拖太久。

解決辦法：請?jiān)诜椒ㄊ炀毢笤龠M(jìn)行操作。

c.原因：微孔間相互污染。

解決辦法： 加樣品時，請小心勿濺出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

d.原因：標(biāo)準(zhǔn)品或酶標(biāo)記物所加入的量不一致。

解決辦法：請使用已校正過的移液槍，并確保其與吸頭之間有高度密合性。

e.原因：添加樣品或試劑的操作方法不正確。

解決辦法：加樣品或試劑時，吸頭請勿接觸微孔。

f.原因：洗板過程發(fā)生問題(如管路堵塞、洗完板后未立刻進(jìn)行下一步驟)。

解決辦法：請隨時監(jiān)控洗板機(jī)洗板過程，洗完后立即進(jìn)行下一步驟。

3. 吸光值均偏高(或線性不夠陡)。

a.原因：室溫太高(>25℃)。

解決辦法： 若無法降低室內(nèi)溫度，請適當(dāng)縮短步驟4的溫育時間。

b.原因：底物溶液受到污染。

解決辦法： 若發(fā)現(xiàn)底物溶液已呈現(xiàn)淡藍(lán)色，請不要再使用。

c.原因：反應(yīng)時間超過太久。

解決辦法：請控制反應(yīng)時間。

d.原因：酶標(biāo)記物污染了盒內(nèi)其它試劑。

解決辦法：使用過的吸頭應(yīng)立即丟棄，可避免試劑間相互污染，凡是試劑(特別是酶標(biāo)記物與底物溶液)接觸過的容器應(yīng)立即清洗干凈。(先以漂白水浸泡，再以清水沖洗干凈，可確保無殘留)

4. 陰性標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值低于陽性標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值。

a.原因：微孔中的試劑未能充分混合。

解決辦法： 試劑加完后，需輕敲盤四周使其充分混合均勻。

b.原因：洗板過程發(fā)生問題(同2-f.)。

解決辦法：請參考2-f.

c.原因：添加樣品或酶標(biāo)記物的量不一致。

解決辦法： 請參考2-d.

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