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簡(jiǎn)要描述:上海篤瑪生物科技有限公司專(zhuān)業(yè)供應(yīng)各種ELISA試劑盒產(chǎn)品,主要包括:人、 大小鼠、兔、犬、牛、猴、豬、昆蟲(chóng)、植物、農(nóng)殘等種屬ELISA 試劑盒。猴轉(zhuǎn)錄激活因子-5(ATF-5)酶聯(lián)免疫試劑盒
猴轉(zhuǎn)錄激活因子-5(ATF-5)酶聯(lián)免疫試劑盒
實(shí)驗(yàn)原理
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)是一種常用的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),其基本原理是利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng),通過(guò)酶促反應(yīng)放大信號(hào),檢測(cè)微量的蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)。ELISA實(shí)驗(yàn)中所需的試劑和耗材需滿(mǎn)足一定的質(zhì)量要求,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:
1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正?,F(xiàn)象,可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超過(guò)50℃,使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫)。當(dāng)日使用。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘,加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,旋緊管蓋,靜置10分鐘,上下顛倒數(shù)次,待其充分溶解后,用移液器將其輕輕混勻(濃度為8000pg/mL)。然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诜磻?yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?。建議配制成以下濃度:按照稀釋方法圖例 標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5mL10ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液的EP管中,混勻即可,其余濃度依此類(lèi)推。
4. 生物su化抗體工作液:實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì)),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘,以生物su化抗體稀釋液稀釋濃縮生物su化抗體(1:100)成工作濃度。當(dāng)日使用。
5. 酶結(jié)合物工作液:實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì)),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘,以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。
當(dāng)日使用。
猴轉(zhuǎn)錄激活因子-5(ATF-5)酶聯(lián)免疫試劑盒
操作步驟:
1. 加樣:設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl。注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如果樣品濃度過(guò)高,可以用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)箻悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍。
2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加生物su標(biāo)記抗體工作液 100μl(取1μl生物su標(biāo)記抗體加99μl生物su標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制),37℃,60分鐘。溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干。
3. 每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液(同生物su標(biāo)記抗體工作液) 100μl,37℃,60分鐘。溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干。
4. 依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
5. 依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
6. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果判斷:
1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖,如設(shè)置復(fù)孔,則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
2. 推薦使用專(zhuān)業(yè)的曲線(xiàn)制作軟件,如curve expert 1.3或1.4,在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度,乘以稀釋倍數(shù);亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
3. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè),計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
1. 抗原和抗體的儲(chǔ)存:應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求存放抗原和抗體,避免反復(fù)凍融和長(zhǎng)時(shí)間暴露在高溫環(huán)境中。同時(shí)要保證試劑盒未過(guò)期,以獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2. 加樣技術(shù):加樣時(shí)應(yīng)保證加入的體積準(zhǔn)確且不產(chǎn)生氣泡,避免加在孔壁的邊緣,以免影響與固相表面的接觸。加樣時(shí)應(yīng)在每孔的旁邊放置一個(gè)加樣對(duì)照孔,以監(jiān)測(cè)加樣的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。
3. 溫育:溫育是ELISA實(shí)驗(yàn)中的重要步驟,溫育時(shí)間和溫度的控制對(duì)于抗原抗體反應(yīng)的進(jìn)行和結(jié)果的影響至關(guān)重要。必須嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行溫育,并注意保持恒溫狀態(tài)。
4. 洗滌:洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)中的一步,它可以去除未結(jié)合的物質(zhì),提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。洗滌時(shí)應(yīng)保證每次洗滌時(shí)間充足,并更換洗滌液以保證洗滌效果。同時(shí)要避免在洗滌過(guò)程中產(chǎn)生氣泡,以免影響洗滌效果。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心 30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液:3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解 凍并確保樣品均勻地充分解凍。
什么時(shí)候進(jìn)行ELISA測(cè)試時(shí)需要準(zhǔn)備一系列稀釋樣本?
1)未知樣本濃度:當(dāng)你不知道樣本中抗原或抗體的濃度時(shí),準(zhǔn)備一系列稀釋樣
可以幫助確保至少有一些稀釋度落在ELISA的線(xiàn)性檢測(cè)范圍內(nèi)。
2)避免信號(hào)飽和:對(duì)于濃度較高的樣本,稀釋可以防止信號(hào)飽和,即吸光度值超
出光度計(jì)的最大讀數(shù),從而保證結(jié)果的線(xiàn)性和準(zhǔn)確性。
3)減少高劑量掛鉤效應(yīng):在某些情況下,過(guò)高的抗原濃度會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)抗體無(wú)法形
成“夾心"結(jié)構(gòu),反而降低了檢測(cè)信號(hào),這稱(chēng)為“掛鉤效應(yīng)"。稀釋樣本可以避免這一
現(xiàn)象。
4)優(yōu)化檢測(cè)條件:為了找到最佳的檢測(cè)條件和稀釋度,初步實(shí)驗(yàn)通常會(huì)涵蓋廣泛
的稀釋范圍,以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以直接使用最佳稀釋度。
5)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):對(duì)于定量ELISA,需要使用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)
曲線(xiàn),未知樣本的結(jié)果將與此曲線(xiàn)比較以確定其濃度。
6)控制非特異性結(jié)合:稀釋樣本可以減少非特異性結(jié)合,這種結(jié)合可能在高濃度
樣本中更為常見(jiàn)。
7)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和可比性:為了確保實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可比性,對(duì)于不同時(shí)間點(diǎn)或不
同實(shí)驗(yàn)條件下的樣本,通常需要準(zhǔn)備相同的稀釋系列。
8)特殊樣本類(lèi)型處理:某些樣本類(lèi)型(如血清、血漿或含有抑制劑的樣本)可能
需要稀釋以減少背景干擾或抑制劑的影響。
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