輔酶ⅠNAD(H)含量測(cè)試盒 

本品用于科研實(shí)驗(yàn),不用于臨床。

測(cè)定意義:
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要?dú)涫荏w,生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧,在合成 ATP 的同時(shí),形成大量的 ROS,同時(shí) NADH 再生為 NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過(guò)這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)及 NADH/NAD+比值說(shuō)明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過(guò)氧化狀態(tài)。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循環(huán)。另外,NAD+降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測(cè)定原理:
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD+和 NADH,NADH 通過(guò) PMS 的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT)為甲瓚,在 570nm 下檢測(cè)吸光值;而 NAD+可被乙醇脫氫酶還原為 NADH,進(jìn)一步采用 MTT 還原法檢測(cè)。

需自備的儀器和用品:
酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:
酸性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;
堿性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體 10 mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:液體 3 mL×1 瓶,4℃保存;
試劑三:粉劑×1 瓶,-20 ℃保存,用時(shí)加入 3mL 蒸餾水,混勻,用不完的試劑 4℃保存一周;
試劑四:粉劑×1 瓶,4 ℃保存,用時(shí)加入 3mL 蒸餾水,混勻,用不完的試劑 4℃保存一周;
試劑五:液體 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存;
試劑六:液體 30mL×1 瓶,4 ℃保存;
試劑七:液體 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NAD+和 NADH 的提取:

1 血清(漿)中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1mL 血清(漿),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
NADH 的提取:按照血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1mL血清(漿),加入 1mL 堿性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2 組織中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加入 1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
NADH 的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加入 1mL堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):酸性提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 酸性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心
10min,取上清,置冰上待測(cè)。NADH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):堿性提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 堿性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。


充分混勻,靜置 5min 后,20000g,25℃離心 5min,棄上清,沉淀中加入:

混勻,取 200μL 轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下讀取對(duì)照吸光值 A1 和測(cè)定管吸光值 A2,計(jì)算△A=A2-A1。

注意事項(xiàng):
1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。
2、對(duì)照管和測(cè)定管的測(cè)定步驟的區(qū)別:對(duì)照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測(cè)定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。
3、反應(yīng)過(guò)程中注意避光。
4、若 NAD+測(cè)定中△A(A2-A1)≤0.0302,NADH 測(cè)定中△A(A2-A1)≤0.0222,說(shuō)明樣本中輔酶含量較低,已低于檢測(cè)限,可做如下調(diào)整:(1)將測(cè)定管避光靜置時(shí)間 20min 延長(zhǎng)到 60min;(2)在提取階段增加取樣量,即取 0.2g 樣本或 0.2mL 樣本加入 1mL 提取液。
5、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管,本試劑盒 100 管保證測(cè) 48 個(gè) NAD+或 NADH.

NAD+和 NADH 含量的計(jì)算:
(一) NAD+含量的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.1475x + 0.0302,R2 = 0.9978;其中 y 為△A,x 為 NAD+濃度 nmol/mL
1、血清(漿)中 NAD+含量計(jì)算
NAD+含量(nmol/mL)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+含量計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
NAD+(nmol/mg prot)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302)÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
NAD+(nmol/g 鮮重)= [(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302)÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
NAD+(nmol/104 cell)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302)

(二)NADH 含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.1404x + 0.0222,R2 = 0.9976;其中 y 為△A,x 為 NADH 濃度 nmol/mL
1、血清(漿)中 NADH 含量計(jì)算
NADH 含量(nmol/mL)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算
NADH (nmol/g 鮮重)=[(△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

注 意: 檢測(cè)限為 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot

輔酶ⅠNAD(H)含量測(cè)試盒

生化試劑盒可以檢測(cè)的樣本類型有哪些?
生化試劑盒的實(shí)驗(yàn)原理是基于化學(xué)反應(yīng),理論上是不受生物種屬及樣本類型的限制。生化試劑盒樣本檢測(cè)通常只分樣本類型,不分種屬。但是某些指標(biāo)在不同種屬或類型樣本中的提取方式不同。因此,具體情況請(qǐng)參見說(shuō)明書或與技術(shù)支持聯(lián)系確認(rèn)。

生化試劑盒樣本檢測(cè)的一般要求:
1)于生化檢測(cè)而言,樣本無(wú)溶血、脂血、的現(xiàn)象。組織樣本需將血液洗凈擦干后再進(jìn)行稱重處理。
2)樣本處理后盡快進(jìn)行檢測(cè),且保存于冰盒之上,待測(cè)。
求
3)樣本需澄清,若不澄清,需離心后取上清進(jìn)行檢測(cè)(特殊指標(biāo)除外)。
4)樣本值應(yīng)在試劑盒線性范圍內(nèi),若超過(guò)線性范圍,需稀釋后再進(jìn)行檢測(cè),若低于檢測(cè)范圍,需增加樣本濃度后進(jìn)行檢測(cè)。

微量法和分光光度法的區(qū)別?
分光光度法:主流測(cè)定體系為1mL,測(cè)試儀器分光光度計(jì),能夠大限度地滿足絕大多數(shù)用戶的需要。
微量法:主流測(cè)定體系為0.2mL,測(cè)試儀器或分光光度計(jì),測(cè)定更加簡(jiǎn)便快捷。

試劑盒規(guī)格中是100管和50管是什么意思?
(1)50管/48樣:50管指能夠做50次測(cè)定,48樣指可以測(cè)試48個(gè)樣品。如果每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,那么只能測(cè)定16個(gè)樣品。其中有2次測(cè)定用于
空白管或者對(duì)照管。值得特別注意的是,50管/24樣中由于每個(gè)樣品測(cè)定都需要做對(duì)照,因此能夠測(cè)定樣品的數(shù)量?jī)H為8個(gè)(假設(shè)做3次重復(fù))

(2)100管/96樣:100管指能夠做100次測(cè)定,96樣指可以測(cè)定96個(gè)樣品,如果每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,那么只能測(cè)定32個(gè)樣品。其中有4次測(cè)定用
于空白管或者對(duì)照管。注意由于瓶璧和移液器吸附等,通常要比理論測(cè)定次數(shù)少1~3次。其它規(guī)格的含義依次類推。值得特別注意的是,100
管/48樣中由于每個(gè)樣品測(cè)定都需要做對(duì)照,因此能夠測(cè)定樣品的數(shù)量?jī)H為16個(gè)(假設(shè)做3次重復(fù))。

如何防止試劑盒失效?
不要過(guò)早訂購(gòu),以免試劑盒失效.收到試劑盒后,檢查外包裝是否正常。馬上打開,按照試劑盒說(shuō)明書核對(duì)試劑數(shù)量是否正確,注意瓶中試劑狀態(tài)是否與說(shuō)明書一致。如果有問(wèn)題,或者懷疑,馬上聯(lián)系公司銷售,進(jìn)行確認(rèn)。如果沒(méi)有問(wèn)題,請(qǐng)務(wù)必按照說(shuō)明書進(jìn)行試劑的保存。注意,不同試劑,可能需要分別保存在常溫(25°℃)、4℃和-20℃,務(wù)必分別按照要求保存,不要整個(gè)試劑盒放置于冰箱。

如何進(jìn)行預(yù)測(cè)定?
(1)務(wù)必在7個(gè)工作日內(nèi)進(jìn)行預(yù)測(cè)定,以確定該試劑盒是否適合您的樣品,以免造成試劑盒和樣品的浪費(fèi)。
(2)選擇2~3個(gè)預(yù)期差異比較大的樣品,嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作,注意儀器工作狀態(tài),操作規(guī)范,控制好測(cè)定條件,尤其是溫度。
(3)如實(shí)與公司銷售溝通預(yù)測(cè)定結(jié)果,公司技術(shù)人員會(huì)確認(rèn)測(cè)定結(jié)果是否正常,是否需要調(diào)整,如何進(jìn)行調(diào)整,從而確保您的測(cè)定結(jié)果可靠。


比色皿有哪些規(guī)格?
(1)常量比色皿,如1mL和3mL等,常量法試劑盒都是選用1mL體系,只能用1mL比色皿,不可以用更大體積的比色皿,否則試劑量不夠,無(wú)法正常比色。

(2)微量比色皿,如0.25mL和0.5mL等,微量法試劑盒都是選用0.25mL比色皿。一般客戶都選擇使用標(biāo)儀(需要自備酶標(biāo)板)

(3)紫外波長(zhǎng)檢測(cè)需要石英比色皿,不可以用普通玻璃比色皿。

(4)不同規(guī)格的比色皿,其外觀大小是一致的,都是1cm光徑(也有0.5cm光徑的比色皿,不常見,也可以用,但是計(jì)算時(shí)要注意修改計(jì)算公式),其內(nèi)
容積差異在于壁的厚度。

代測(cè)的優(yōu)點(diǎn)
(1)更加省事兒,不必為測(cè)定犯難。用戶只要提供樣品和想測(cè)定的指標(biāo),就不再需要為測(cè)定操心了,不再受到操作技能、儀器設(shè)備和時(shí)間
的限制,就等著拿到數(shù)據(jù)寫論文。

(2)測(cè)定數(shù)據(jù)更有保障。我們經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期努力,建立了擁有豐富測(cè)定經(jīng)驗(yàn)的測(cè)定團(tuán)隊(duì)、以進(jìn)口儀器設(shè)備為主的
測(cè)定平臺(tái)(尤其是自動(dòng)勻漿機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器)和自己研發(fā)和生產(chǎn)的試劑盒,嚴(yán)格的測(cè)定質(zhì)量管理體系,從而保證了測(cè)定結(jié)果的真實(shí)可靠。我們還建立了定制度。即先對(duì)用戶樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)定,并且與用戶就預(yù)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行充分溝通,在預(yù)測(cè)定結(jié)果得到用戶認(rèn)可的情況下,才與用戶簽訂代測(cè)合同。

(3)防止樣品損失無(wú)論是用戶自己完成測(cè)定全過(guò)程,還是購(gòu)買試劑盒完成測(cè)定,都可能因?yàn)槿狈y(cè)定經(jīng)驗(yàn),導(dǎo)致測(cè)定失敗,
從而損失樣品的情況。對(duì)于生命科學(xué)研究而言,樣品是最珍貴的。樣品一旦損失,輕則造成研究進(jìn)度被耽擱,重則造成研究失敗!代測(cè)能夠充分保證測(cè)定成功,從而防止了樣品損失。當(dāng)然,樣品質(zhì)量是測(cè)定成功的前提,而且樣品質(zhì)量只有用戶自己才能控制和保證。

生化檢測(cè)試劑盒的基本原理
生化檢測(cè)試劑盒,又稱生化試劑盒,是利用特定的生物成分、動(dòng)力學(xué)及化學(xué)反應(yīng)等技術(shù)制備的試劑盒,用于檢測(cè)生理學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域中特定的生物分子或化學(xué)物質(zhì)。生化檢測(cè)試劑盒包括底物、酶試劑盒、探針等多個(gè)組成部分,其中的是底物-酶法。

底物-酶法是生化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的基本原理。在該過(guò)程中,底物與酶在細(xì)胞膜上結(jié)合形成基質(zhì)酶,進(jìn)而形成底物-酶復(fù)合物。隨著時(shí)間的推
移,底物-酶復(fù)合物逐漸分解,釋放出分子小的底物和分子大的未消化的底物。未消化的底物可以被一系列的酶代謝,同時(shí)底物、酶和代謝產(chǎn)物都會(huì)對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,從而影響檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果。

生化試劑盒可以檢測(cè)的樣本類型有哪些?
生化試劑盒的實(shí)驗(yàn)原理是基于化學(xué)反應(yīng),理論上是不受生物種屬及樣本類型的限制。生化試劑盒樣本檢測(cè)通常只分樣本類型,不分種屬。但是某些指標(biāo)在不同種屬或類型樣本中的提取方式不同。因此,具體情況請(qǐng)參見說(shuō)明書或與技術(shù)支持聯(lián)系確認(rèn)。

生化試劑盒樣本檢測(cè)的一般要求:
1)于生化檢測(cè)而言,樣本最-好無(wú)溶血、脂血、黃-疸的現(xiàn)象。組織樣本需將血液洗凈擦干后再進(jìn)行稱重處理。
2)樣本處理后最-好盡快進(jìn)行檢測(cè),且保存于冰盒之上,待測(cè)。
3)樣本需澄清,若不澄清,需離心后取上清進(jìn)行檢測(cè)(特殊指標(biāo)除外)。
4)樣本值應(yīng)在試劑盒線性范圍內(nèi),若超過(guò)線性范圍,需稀釋后再進(jìn)行檢測(cè),若低于檢測(cè)范圍,需增加樣本濃度后進(jìn)行檢測(cè)。