綿羊脫氫表雄酮(DHEA) ELISA 試劑盒

試劑盒局限
6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到精確的結果。
試劑盒性能
1、靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2、特異性：不與其它細胞因子反應。
3、重復性高：板內、板間變異系數均小于10%。

如何保證ELISA試劑盒的質量
辦法學的影響
ELISA測定模式包含以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競賽抑制法，其中競賽抑制法(HBeAb,HBcAb等采用)因受操作時差所引起的平競賽等要素的影響，成果重復性較差，質量較難控制。
第二、試劑要素
不同批次的ELISA試劑在制造進程中很難確保質量一致，即使是經過批批檢的項目其檢測成果也存在差異，因而必須選擇和訂貨長批號的試劑，并確保保存條件。嚴厲執(zhí)行這一規(guī)范可以防止因試劑批號改動而從頭樹立質控系統及從頭評估試劑的雜亂進程，并且可以確保成果的穩(wěn)定性；對于效期短、使用率低的試劑，應當小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，防止重復凍融造成試劑的失效。
第三、樣本要素
標本攪擾要素包含內源性攪擾要素和外源性攪擾要素，ELISA試劑盒前者包含類風濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、等，后者包含標本溶血、標本被細菌污染、標本儲存時間過長、標本凝結不全、冷凍標本的重復凍融等。
第四、操作要素
ELISA操作步驟雜亂，操作不當將引起較大的誤差。加樣、溫育、洗滌、顯色、比色。
 第五、灰區(qū)的設置
通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性"和“陰性"來陳述成果，兩者間有一條分界線被稱為
“陽性判斷值"(cut-off value，CO值)，這是定性免疫測定成果陳述的依據。

第六、標本復查
ELISA手工檢測進程雜亂，影響要素較多，即使室內質控在控，也可能因孔間差異而造成成果的差異，因而加大復查力度是確保成果準確性的牢靠辦法，比如對HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項目的可疑、弱陽性標本及罕見模式的檢測成果進行復查。
第七、常表明成果的常用辦法
1.定性測定
2.半定量測定 成果一般以滴度表明。
3.定量測定 即用已知量的規(guī)范品作一系列稀釋后進行ELISA測定，制作規(guī)范曲線，成果以jue對量或單位表明。在ELISA試劑盒定量檢測中每一塊反應板都必須制作相應的規(guī)范曲線。
不按說明書操作會造成的后果
     
每一個試劑盒里都會有對應的說明書，注意事項里大多都會提到“實驗嚴格按照說明書的操作進行"。為什么要嚴格按照說明書操作？為了更完整的回答這個問題，需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。
根據試劑的來源和標本的性狀及檢測的具體條件，可設計出不同類型的檢測方法。大致分為以下幾類：
1.雙抗體夾心法測抗原
2.雙抗原夾心法測抗體
3.競爭法測抗原
4.間接法測抗體
 
總結如果不按說明書操作可能會出現的不滿意結果。
A. 先說最嚴重的操作錯誤，看錯或壓根不看試劑盒配套說明書，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當作雙抗體夾心法來做，導致的結果就是整板顯示很強的藍色，無任何梯度。
B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導致的結果是，浪費珍貴的樣本，樣品的回收率達不到預期值，如果混用不同試劑盒的酶復合物，會導致顯色過弱或過強，因為每種試劑盒所用酶復合物效價可能不一樣。
C. 不看文獻或者不做預實驗。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻報道推算樣本應該1:10稀釋，結果稀釋成1:1000，導致的結果是顯色過弱，結果不可用。
D. 不校準移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導致工作試劑濃度不準確，孵育溫度不合適，實驗帶來誤差。
E. 洗滌不充分，每孔洗液加樣過少，或者殘留。導致的結果是顯色過快，同時背景較高。
 F. 手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液，導致洗液污染，整個實驗失敗。
G. 剩余酶標板條未及時放入干燥袋，導致酶標板受潮，下一次再做時，顯色過弱或污染，CV值過高。




怎么挑選適合自己實驗的抗體
一、關于特異性的挑選：
特異性的挑選首要需求考慮四個方面：蛋白特異性、種屬特異性、試驗方法特異性、符號物的特異性。
1、蛋白特異性：
針對需求檢測的蛋白查找抗體，幾個細節(jié)要區(qū)分，重組表達的蛋白和內源性蛋白的檢測，對抗體的要求是不一樣的，注意檢查抗體說明書的檢測說明。假如重組蛋白不是全長表達，則需求注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內。
內源性蛋白能清楚其剪切與潤飾的方式，特殊表型的蛋白需求進行序列比對，并結合抗體免疫原序列，檢查穿插反應的狀況。磷酸化蛋白檢測需求確認具體位點，不同位點的磷酸化意味著或許有不同的機制存在，不宜混為一談。
2、種屬特異性：
同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或規(guī)劃多肽抗原的，根據蛋白的同源性狀況與其他種屬發(fā)生穿插反應。需求參照說明書注明的可反應種屬信息。
一些稀有種屬很難找到抗體，可以經過蛋白的序列比對，挑選同源序列免疫的抗體，不過一般這種狀況生產商不會受理其關于質量的申述，假如可以申請到免費的抗體樣品，則利于抗體挑選。。
3、符號物的特異性
一般基于試驗操作的試驗方法不會運用帶有符號的一抗，比方WB、IHC等，都是經過二抗類的試劑符號達到成果出現的意圖?？墒腔趦x器剖析的一些試驗，或許就會運用到直接符號的一抗，比方流式試驗。那么需求了解到自己將要運用的儀器能檢測到的熒光規(guī)模，針對不通的參數要求挑選對應的符號物。在免疫熒光雙標試驗中，需求選配不同的熒光符號物。

二、抗體種屬來歷的挑選：
     有人以為單抗比多抗好，其實這并不是一個嚴謹的觀點，只能說在或許性上單抗的特異性更好一些，而多抗的親和力會優(yōu)于單抗，而且特異性并不一定就遜于單抗，首要看抗原的規(guī)劃水平。
目前商品化抗體里單抗首要是鼠單抗、兔單抗，多抗首要是兔多抗、山羊多抗等，其他種屬來歷抗體較少。不主張糾結于單抗好還是多抗好，能做出試驗的抗體便是好抗體。
在挑選上一般主張試驗種屬和抗體種屬親緣性越遠越好，不宜同源?？贵w不同種屬會要影響接下來二抗的選配。特別是在免疫熒光雙標試驗中，需求在差異于試驗種屬的基礎上，區(qū)分開兩個目標的抗體種屬來歷，以便于二抗差異識別。

三、關于品牌的挑選：
     由于抗體品質的異質化，關于抗體的品牌挑選就被我們所注重，可是不管是什么品牌都難免會遇到不合適自己試驗的抗體。所以一般主張考慮那些業(yè)界普遍認可、購買方便、專業(yè)、售后處理快捷的品牌。
一些乃至都沒有正式代理的，只能備選。一起購買時一定要找可以供給產品指導、試驗剖析、售后處理的正規(guī)代理商購買，防止由于買到假貨水貨影響試驗。
其實或許只是生產商只檢測時運用了不同的種屬不同的樣品類型，或是參照了不同的文獻，對運用者來說，相同的樣品，不管運用哪個品牌的，只需抗體是對的，意圖條帶只會出現在相同的位置。

ELISA試劑盒技術流程 

技術提示：
1、混合蛋白溶液時，避免起泡。
2、加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。
3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。
4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經失效，不得使用。
5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產物，會瞬間變?yōu)辄S色。
6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。
8、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。
 
試劑盒性能：
1. 樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
2. 批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。

操作注意事項
1）試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
2）實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
3）不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4）使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5）使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6）洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7）底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8）加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9）按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
試劑盒試劑的準備
1）標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。
2）洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。
試劑盒操作步驟
1）使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2）根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內。
3）加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4）甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6）甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8）取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9）在450nm波長處測定各孔的OD值。
結果判斷與分析
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的待測物質標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的待測物質含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

綿羊脫氫表雄酮(DHEA) ELISA 試劑盒   

本試劑供研究使用       

實驗目的：

本試劑盒可用于測定血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液等
自備材料

1）蒸餾水。
2）加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3）振蕩器及磁力攪拌器等。

試劑盒安全性

1）避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2）實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3）不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

 

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
 

操作步驟

1. 標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。
4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。
8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
9. 測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
 
 計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項：

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。
2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。