綿羊肝配蛋白 (EPHA1) ELISA 試劑盒

產品規(guī)格：96T/48T

實驗方法：夾心法

檢測范圍：78-5000pg/mL

檢測限：34.2pg/mL

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· 離開了細胞培養(yǎng)皿，還能愉快做實驗嗎

· 培育皿一般用玻璃或塑料制成，是培育微生物或細胞培育的常用試驗耗材，一般玻璃的能夠用于植物資料、微生物培育和動物細胞的貼壁培育也可能用到。塑料的可能是聚乙烯資料的，合適試驗室接種、劃線、分離細菌的操作，能夠用于植物資料的培育。培育皿易碎，在清洗和運用時要當心輕拿輕放，運用完后要及時清洗潔凈，存放在安全、固定的方位。

培育皿的清潔：

1、浸泡：新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿運用前得先用自來水簡略沖刷，然后用5%鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有許多蛋白質和油脂，干枯后不易沖刷掉，故用后應立即浸入清水中備沖刷。

2、沖刷：將浸泡后的玻璃器皿放到洗刷劑水中，用軟毛刷重復沖刷。不要留死角，并避免損壞器皿外表的光潔度。將沖刷潔凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。

3、.浸酸：浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強氧化作用鏟除器皿外表的可能殘留物質。浸酸不該少于六小時，一般過夜或更長。放取器皿要當心。

4、沖刷：沖刷和浸酸后的器皿都必須用水充沛沖刷，浸酸后器皿是否沖刷的潔凈，直接影響到細胞培育的勝敗。手藝洗刷浸酸后的器皿，每件器皿至少要重復“灌水－倒空"15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包裝備用。

· 培育皿運用留意事宜：

1、運用前通過清潔消毒，培育皿清潔與否對作業(yè)影響較大，可影響培育基的酸堿度，若有某些化學藥品的存在，會按捺細菌成長。

2、新購的培育皿應先用熱水沖刷，再置于分數(shù)為1%或2%的鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時，使游離堿性物質除掉，再用蒸餾水沖刷2次。

3、若要培育細菌，再用高壓蒸氣(一般6.8*10的5次方Pa高壓蒸氣)，120℃的溫度下30min滅菌，置室溫中枯燥，或用干熱滅菌，就是將培育皿置于烘箱內，溫度控制在120℃左右的情況下保持2h，即可殺死細菌的胞牙。

4、通過消毒的培育皿才干接種培育運用。

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ELISA試劑盒里都包含了哪些？

一、濃縮

由于凈化進程中引入的溶劑，可能會下降待測組分的濃度或許不適宜直接分析，需求去除悉數(shù)有機溶劑。即試劑盒前處理進程中把樣本在60℃氮氣下吹干，再用復溶液溶解單調殘留物。

濃縮辦法：氮氣吹干除雜、壓縮空氣吹干除雜。

二、均質

①組織樣本：肉、肝食品類切細，用絞肉機反復絞碎，混合均勻。

②水產樣本：去除樣品的非食用部分，食用部分切細，用均質器均漿；材料表面較臟時,需適當用蒸餾水清洗。

③蛋類：鮮蛋去殼，蛋黃和蛋白充分混勻。

④生果、蔬菜類：先用水洗去泥沙，ELISA試劑盒然后除去表面的水分，取食用部分。

· 三、振蕩提取

· 將提取溶劑參與到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使提取溶劑與容器內的樣品充分接觸以深化到樣本組織內部，提取待測組分。

①振蕩辦法：振蕩器上進行上下、往復式振蕩、手搖式上下振蕩。

②在組織樣本中參與有機溶劑之間提取時，應邊加邊振蕩，避免組織凝集成團，不利于提取。

四、請留心：

①在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，避免雜質煩擾。

②在吹樣本時，針頭應在液面上空，避免與樣本接觸，避免發(fā)作交叉污染。

③樣本吹干后應當即取下，ELISA試劑盒避免吹的時間過長，影響畢竟檢測成果。

④不同的藥物，吹干后樣本的保質期不同，建議待樣本回到室溫后當即復溶。

如何保證ELISA試劑盒的質量

一、辦法學的影響

ELISA測定模式包含以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競賽抑制法，其中競賽抑制法(HBeAb,HBcAb等采用)因受操作時差所引起的平競賽等要素的影響，成果重復性較差，質量較難控制。

二、試劑要素

不同批次的ELISA試劑在制造進程中很難確保質量一致，即使是經(jīng)過批批檢的項目其檢測成果也存在差異，因而必須選擇和訂貨長批號的試劑，并確保保存條件。嚴厲執(zhí)行這一規(guī)范可以防止因試劑批號改動而從頭樹立質控系統(tǒng)及從頭評估試劑的雜亂進程，并且可以確保成果的穩(wěn)定性；對于效期短、使用率低的試劑，應當小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，防止重復凍融造成試劑的失效。

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· 三、樣本要素

· 標本攪擾要素包含內源性攪擾要素和外源性攪擾要素，ELISA試劑盒前者包含類風濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體等，后者包含標本溶血、標本被細菌污染、標本儲存時間過長、標本凝結不全、冷凍標本的重復凍融等。

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· 四、操作要素

· ELISA操作步驟雜亂，操作不當將引起較大的誤差。加樣、溫育、洗滌、顯色、比色。

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· 五、灰區(qū)的設置

· 通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性"和“陰性"來陳述成果，兩者間有一條分界線被稱為

· “陽性判斷值"(cut-off value，CO值)，這是定性免疫測定成果陳述的依據(jù)。

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· 六、標本復查

· ELISA手工檢測進程雜亂，影響要素較多，即使室內質控在控，也可能因孔間差異而造成成果的差異，因而加大復查力度是確保成果準確性的牢靠辦法，比如對HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項目的可疑、弱陽性標本及罕見模式的檢測成果進行復查。

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· 七、常表明成果的常用辦法

· 1.定性測定

· 2.半定量測定 成果一般以滴度表明。

· 3.定量測定 即用已知量的規(guī)范品作一系列稀釋后進行ELISA測定，制作規(guī)范曲線，成果以jue對量或單位表明。在ELISA試劑盒定量檢測中每一塊反應板都必須制作相應的規(guī)范曲線。

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· 不按說明書操作會造成的后果

· 每一個試劑盒里都會有對應的說明書，注意事項里大多都會提到“實驗嚴格按照說明書的操作進行"。為什么要嚴格按照說明書操作？為了更完整的回答這個問題，需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。

· 根據(jù)試劑的來源和標本的性狀及檢測的具體條件，可設計出不同類型的檢測方法。大致分為以下幾類：

· 1.雙抗體夾心法測抗原

· 2.雙抗原夾心法測抗體

· 3.競爭法測抗原

· 4.間接法測抗體

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穩(wěn)定性
經(jīng)測定，試劑盒在有效期內按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。

注意：
試劑盒內酶標條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在實驗后 1個月內使用完畢。產品過期時間以盒子上的標簽為準，保質期內所有組分都確保是穩(wěn)定的。

綿羊肝配蛋白 (EPHA1) ELISA 試劑盒

一個包裝的本試劑盒，包括標準品檢測，可以進行96次檢測。
保存條件：
除標準品外，4℃保存6個月內有效。標準品4℃保存，1-2周內有效，-20℃保存6個月內有效。

注意事項：
   由于標準品一般是凍干粉，在制備后需要嚴格校準，所以標準品的瓶數(shù)及每瓶標準品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標準品標簽上的標注為準。
   洗滌液(20X)在低溫下可能有結晶，如果發(fā)現(xiàn)有結晶，請室溫水浴加熱使結晶溶解后再配制工作液。
     為保證標準品的精確性，標準品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
   TMB對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當防護以避免直接接觸人體或吸入體內。
   加樣時，請注意每個樣品或標準品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
   不宜混用不同批號的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過獨立測試。
   充分混勻對保證反應結果的精準性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
   本試劑盒很多操作在室溫進行，要求嚴格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導致最終檢測到的吸光度顯著下降。
   洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。
   檢測標準品和樣品時建議設置重復孔，以確保檢測結果的可信度。
   加樣過程中須避免氣泡的產生。

本產品限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 樣品準備
a. 樣品的準備請按下列流程進行操作：
(a) 細胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b) 對于血清樣品，將全血在室溫放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c) 對于血漿樣品，采集的全血使用肝素或者EDTA進行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d) 若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復凍融。
b. 血清樣品不應添加任何防腐劑或抗凝劑。
c. 樣品應清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應通過離心去除。
d. 請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結果將不準確。
注：血清或血漿樣品可能需要用樣品分析緩沖液適當稀釋后再檢測。

2. 檢測前準備工作
a. 試劑盒從冰箱中取出后應置室溫(25-28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。

b. 配制適當量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
c. 按標準品標簽上標注的體積加入標準品稀釋液至1瓶標準品中，室溫孵育15分鐘(為確保標準曲線的準確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標準品溶解，使標準品終濃度達到4000pg/ml。

通常每個濃度的標準品需要檢測2個孔，每個孔的標準品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標準品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標準品，并在合并混勻后使用。

d. 取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預先加入250μl的標準品稀釋液，并參考圖2進行標準品的倍比稀釋，最終得到4000、2000、1000、500、250、125pg/ml共六個標準品濃度，最后將稀釋好的標準品依次加入預包被板孔中，標準品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標準品濃度。

ELISA實驗因靈敏度高，特異性強在生物科研上得到了廣泛的認可，但對初學者而言，如不注意實驗操作過程中的各個環(huán)節(jié)，可能會對最終的實驗結果產生比較大的影響，比如實驗出現(xiàn)白板，顯色弱靈敏度低，花板無梯度背景高等現(xiàn)象。下面對以上實驗現(xiàn)象進行一一解析。

1.白板現(xiàn)象
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中所有孔的顏色均為無色，即無信號呈現(xiàn)。
出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：
a.試劑已過保質期，不同批次稀釋液交叉使用。
b.錯加漏加檢測A，檢測B或者底物溶液TMB。
c.洗板或者加樣過程中，酶標記物被污染失活，稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等。
d.配置稀釋液的蒸餾水可能被污染。
e.洗滌液是濃縮型的，沒有按比例進行稀釋。
f.酶標記物的活性和效價比較低。

g.溶液的PH值不正確，一般稀釋液的PH值應保持在7.2-7.4。
2.顯色弱靈敏度低
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中孔的顯色比較淺，即只有微弱的信號呈現(xiàn)。
出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：
a.產品過有效期，試劑沒有按規(guī)定進行適當?shù)谋４妗?br/>b.試劑，標準品或者樣品在使用前沒有平衡到室溫。
c.少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當。
d.洗板或者加樣過程中，酶標物受污染失活。
e.孵育時間和孵育溫度未達到實驗要求。
f.洗滌液稀釋倍數(shù)不符合要求，洗板次數(shù)過多，洗板沖擊力過大，洗板浸泡時間過長。
g.底物溶液TMB顯色時間太短。

3.花板無梯度背景高
在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中的孔有顏色但沒有梯度，背景也可能較高.

出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：
a.底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存，實驗前溶液已經(jīng)變藍。
b.孵育溫度過高或者孵育時間過長，發(fā)生了較強的非特異性吸附。
c.沒有按說明書要求洗板，特別是洗板時洗滌液的量少加了。
d.加樣時沒有換槍頭造成交叉污染。
e.花板現(xiàn)象：低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測抗體，封閉不足導致的本底不穩(wěn)定，洗板不充分，包被板子的問題。

總結如果不按說明書操作可能會出現(xiàn)的不滿意結果。

A. 先說最嚴重的操作錯誤，看錯或壓根不看試劑盒配套說明書，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當作雙抗體夾心法來做，導致的結果就是整板顯示很強的藍色，無任何梯度。

B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導致的結果是，浪費珍貴的樣本，樣品的回收率達不到預期值，如果混用不同試劑盒的酶復合物，會導致顯色過弱或過強，因為每種試劑盒所用酶復合物效價可能不一樣。

C. 不看文獻或者不做預實驗。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻報道推算樣本應該1:10稀釋，結果稀釋成1:1000，導致的結果是顯色過弱，結果不可用。

D. 不校準移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導致工作試劑濃度不準確，孵育溫度不合適，實驗帶來誤差。

E. 洗滌不充分，每孔洗液加樣過少，或者殘留。導致的結果是顯色過快，同時背景較高。

F. 手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液，導致洗液污染，整個實驗失敗。

G. 剩余酶標板條未及時放入干燥袋，導致酶標板受潮，下一次再做時，顯色過弱或污染，CV值過高。

綜上所述：在ELISA實驗中應注意以下問題：
1.在實驗前應該按相關要求將實驗試劑平衡至室溫。
2.包被抗體和檢測抗體應該是有高活性的且都針對同一抗原。
3.試劑保存：蛋白抗體類試劑保存于-20攝氏度，顯色液洗滌液保存于2-8攝氏度。
4.各試劑在使用前應充分混勻，以保證試劑的均一性和準確性。
5.嚴格控制反應溫度和反應試劑。
6.洗板次數(shù)，洗板液的量，洗板液浸泡時間的長短，洗板的力度都是應該注意的問題。
7.相關濃縮液應按要求稀釋到相應比例方可使用，PH值要保持在7.2-7.4之間。
8.在終止反應時盡量避免微孔中存有氣泡。
9.終止反應完成后應該在2min內完成酶標儀讀數(shù)。
特別提示：本公司的所有產品用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！