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簡(jiǎn)要描述:綿羊肝臟膠原凝集素1(CLL1) ELISA 試劑盒 :質(zhì)量穩(wěn)定,準(zhǔn)確性高。篤瑪生物全程提供技術(shù)指導(dǎo),確保您實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性還提供免費(fèi)代測(cè)服務(wù)。您只需提供代測(cè)樣本,七個(gè)工作日內(nèi)即可為您提供代測(cè)數(shù)據(jù)。歡迎前來(lái)咨詢,訂購(gòu)。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定,又稱酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),即ELISA,是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用的技術(shù)。1971年Engvall等人發(fā)表了使用ELISA定量測(cè)定IgG的文章,將1966年用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。
ELISA的原理
ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上,利用抗原抗體特異性結(jié)合,檢測(cè)過(guò)程中,通常使用洗板的方式去除非結(jié)合物,最終酶促反應(yīng)后的底物的顏色,對(duì)樣本中蛋白進(jìn)行定性與定量。
不按說(shuō)明書(shū)操作會(huì)造成的后果
每一個(gè)試劑盒里都會(huì)有對(duì)應(yīng)的說(shuō)明書(shū),注意事項(xiàng)里大多都會(huì)提到“實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行"。為什么要嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作?為了更完整的回答這個(gè)問(wèn)題,需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。
根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀及檢測(cè)的具體條件,可設(shè)計(jì)出不同類型的檢測(cè)方法。大致分為以下幾類:
1.雙抗體夾心法測(cè)抗原
2.雙抗原夾心法測(cè)抗體
3.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
4.間接法測(cè)抗體
總結(jié)如果不按說(shuō)明書(shū)操作可能會(huì)出現(xiàn)的不滿意結(jié)果。
A. 先說(shuō)最嚴(yán)重的操作錯(cuò)誤,看錯(cuò)或壓根不看試劑盒配套說(shuō)明書(shū),不按操作步驟加樣。比如把競(jìng)爭(zhēng)法的試劑盒當(dāng)作雙抗體夾心法來(lái)做,導(dǎo)致的結(jié)果就是整板顯示很強(qiáng)的藍(lán)色,無(wú)任何梯度。
B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒,所含的試劑成分很可能是不一樣的,混用導(dǎo)致的結(jié)果是,浪費(fèi)珍貴的樣本,樣品的回收率達(dá)不到預(yù)期值,如果混用不同試劑盒的酶復(fù)合物,會(huì)導(dǎo)致顯色過(guò)弱或過(guò)強(qiáng),因?yàn)槊糠N試劑盒所用酶復(fù)合物效價(jià)可能不一樣。
C. 不看文獻(xiàn)或者不做預(yù)實(shí)驗(yàn)。比如某個(gè)試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻(xiàn)報(bào)道推算樣本應(yīng)該1:10稀釋,結(jié)果稀釋成1:1000,導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過(guò)弱,結(jié)果不可用。
D. 不校準(zhǔn)移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導(dǎo)致工作試劑濃度不準(zhǔn)確,孵育溫度不合適,實(shí)驗(yàn)帶來(lái)誤差。
E. 洗滌不充分,每孔洗液加樣過(guò)少,或者殘留。導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過(guò)快,同時(shí)背景較高。
F. 手洗板時(shí)所用槍頭沒(méi)有懸空加入洗液,導(dǎo)致洗液污染,整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。
G. 剩余酶標(biāo)板條未及時(shí)放入干燥袋,導(dǎo)致酶標(biāo)板受潮,下一次再做時(shí),顯色過(guò)弱或污染,CV值過(guò)高。
ELISA常見(jiàn)主要試劑
1. 抗體:單抗特異性強(qiáng),多抗結(jié)合性高,試劑盒需要高效的配對(duì)。
2. 2.抗原:大多為重組蛋白,細(xì)胞因子和待測(cè)樣本,高效標(biāo)準(zhǔn)品需NIBSC/WHO校準(zhǔn)。
3. 3.顯色作用體系:首先辣根過(guò)氧化物酶(HRP)與常見(jiàn)底物TMB和OPD均可形成顯色體系,再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對(duì)-硝基苯磷酸酯可形成黃色底物,還有葡萄糖氧化酶(GOD)的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色,最后β-D-半乳糖苷(β-D-Gal)的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷(4MUG)可生成高強(qiáng)度熒光。
ELISA的類型
根據(jù)試劑的來(lái)源和樣本的情況以及檢測(cè)的具體條件,可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法,按照原理及操作,市面的方法有:
1.間接法ELISA
是檢測(cè)抗體的方法,原理為利用酶標(biāo)記的二抗以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體,顯色測(cè)定。優(yōu)勢(shì)在于待測(cè)一抗無(wú)需標(biāo)記快速便捷。直接法ELISA與間接法ELISA相似,區(qū)別在于一抗酶標(biāo),檢測(cè)孵育也以抗原為主,但直接法ELISA的靈敏度有限,需權(quán)衡使用。
2.夾心法ELISA
又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法ELISA,原理相似,用于檢測(cè)抗體或抗原含量。以雙抗體夾心法為例,捕獲抗體包被在固相載體上,加入抗原或待測(cè)樣本結(jié)合,后加入的檢測(cè)抗體結(jié)合在抗原上,形成三明治夾心形式。雙抗夾心法是市面最常見(jiàn)與方便分析的方法。
3.競(jìng)爭(zhēng)法ELISA
小分子抗原與半抗原的檢測(cè)方法常用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA,待檢樣本中抗原越多,被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量會(huì)減少,彼此形成競(jìng)爭(zhēng)負(fù)相關(guān)體系,顯色物質(zhì)也就越少,根據(jù)顯色物質(zhì)的比例可擬合得到待測(cè)抗原含量。
4.其他方法
a.免疫抑制法測(cè)ELISA:固相包被抗原,被檢樣本對(duì)底物顯色的抑制程度與樣本中所含抗原的量成正比,二者之差為待測(cè)抗原含量,原理類似與競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。
b.阻斷ELISA:目的檢測(cè)特異性抗體,也稱為競(jìng)爭(zhēng)ELISA,原理為固相包被抗原,待測(cè)樣本與一抗酶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)孵育,待檢樣本中抗體越多,顯色越淺,反則反之。非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒中涉及該法。
c.此外有用于檢測(cè)IgM抗體的抗體捕捉ELISA,有固相載體改變的Dot-ELISA(硝酸纖維素膜)和C-ELISA(滌綸布),還有技術(shù)分類的TRFIA和多因子檢測(cè)等。
ELISA的評(píng)估
ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣,優(yōu)秀的試劑盒需要對(duì)如下6大項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定評(píng)估,分析如下:
1、準(zhǔn)確性
ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣,優(yōu)秀的試劑盒需要對(duì)如下6大項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定評(píng)估,分析如下:
a.回收率:測(cè)定試劑盒對(duì)數(shù)據(jù)真實(shí)性的校準(zhǔn),過(guò)高或偏低會(huì)產(chǎn)生加樣和假性性的失準(zhǔn)數(shù)據(jù)。
b.線性:測(cè)定試劑盒稀釋液與樣本微環(huán)境的的準(zhǔn)確性,過(guò)高或偏低均會(huì)出現(xiàn)測(cè)定的偏差。
2、精確度
a.板內(nèi)精確度:評(píng)價(jià)單次實(shí)驗(yàn)中,同一個(gè)已知濃度不同復(fù)孔的差異。
b.板間精確度:評(píng)價(jià)同一樣本,多次實(shí)驗(yàn)的差異。
3、精密度
檢測(cè)限:能顯著區(qū)分空白信號(hào)的最小信號(hào)值對(duì)應(yīng)的濃度,用于評(píng)估試劑盒的靈敏度,值越低試劑盒靈敏度越高。
4、特異性
a.交叉反應(yīng):評(píng)判特異性,不同分子與試劑盒抗體結(jié)合能力,交叉反應(yīng)越大,特異性越差。
b.抗干擾能力:同源物的干擾,內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的干擾。
5.天然樣本檢測(cè)性
對(duì)天然樣本及合適的樣本類型檢測(cè)分析。對(duì)天然樣本類型確定,避免假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。
6、穩(wěn)定性
試劑盒時(shí)效性和穩(wěn)定性是對(duì)指標(biāo)檢測(cè)的重要保障。穩(wěn)定性越高,試劑盒存儲(chǔ)時(shí)間越久。
ELISA的應(yīng)用
ELISA技術(shù)是特定靶標(biāo)蛋白質(zhì)定量的金標(biāo)準(zhǔn),提供快速,穩(wěn)定且易于分析的結(jié)果??梢詫?duì)生物大分子/小分子的定量,對(duì)親和力測(cè)定評(píng)價(jià)或者篩選,還可對(duì)重組蛋白或細(xì)胞因子進(jìn)行活性比對(duì)分析等運(yùn)用。常應(yīng)用于細(xì)胞因子,趨化因子,生長(zhǎng)因子等檢測(cè),同時(shí)應(yīng)用于癌癥、干細(xì)胞、免疫學(xué)、神經(jīng)學(xué)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究領(lǐng)域的靶標(biāo)。
1,酶的底物
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HRP的底物
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HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng),代表性的過(guò)氧化物為H2O2,其反應(yīng)式如下:DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。在ELISA中,DH2一般為無(wú)色化合物,經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物,以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色,用酸終止酶反應(yīng)后,在492nm處有最高吸收峰,靈敏度高,比色方便,是HRP結(jié)合物的底物。OPD本身難溶于水,OPD·2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性,操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見(jiàn)光易變質(zhì),與過(guò)氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定,須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中,OPD和H2O2一般分成二組分,OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式,片劑中含有發(fā)泡助溶劑,使用更為方便。過(guò)氧化氫則配入底物緩沖液中,有制成易保存的濃縮液,使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。
TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色,目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定,可配成溶液試劑,只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液,可直接作底物使用。另外,TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn),因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后,TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色,可在比色計(jì)中定量,最適吸收波長(zhǎng)為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感,但空白值極低,也為一些試劑盒所采用。
另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],經(jīng)HRP作用后,產(chǎn)物顯熒光,可用熒光光度計(jì)測(cè)量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測(cè)定的線性范圍。
HRP對(duì)氫受體的專一性很高,僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用最多,但尿素過(guò)氧化物為固體,作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過(guò)氧化物片劑,用蒸餾水溶解后,在底物緩沖液中密閉、低溫(2~8℃)可穩(wěn)定1年。
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AP的底物
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AP為磷酸酯酶,一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物,可制成片劑,使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚,在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后,黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮),可用于ELISA作熒光測(cè)定,敏感度較高于用顯色底物的比色法。
2,洗滌液
在板式ELISA中,常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。
3, 酶反應(yīng)終止液
常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸,其濃度按加量及比色液的最終體積而異,在板式ELISA中一般采用2mol/L。
4,陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品
陽(yáng)性對(duì)照品(positive control)和陰性對(duì)照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品,同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照,因此對(duì)照品,特別是陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測(cè)定,對(duì)照品最好也為人血清,因?yàn)檎H搜逶诟鞣NELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到,國(guó)外試劑盒中的對(duì)照品多以復(fù)鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料,即在血漿中加入鈣離子,使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固,除去凝塊后所得的液體,其組成與血清相似。陰性對(duì)照品須先行檢測(cè),確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。
例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是陰性。陽(yáng)性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì),其中加入一定量的待檢物質(zhì),此量最好在試劑說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱,在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較,可對(duì)標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國(guó)外檢測(cè)HBsAg的ELISA試劑盒檢測(cè)敏感度約為0.5ng/ml,陽(yáng)性對(duì)照品中含量約為10ng/ml。在對(duì)照品中一般加入抗生素和防腐劑,以利保存。
5,參考標(biāo)準(zhǔn)品
定量測(cè)定的ELISA試劑盒(例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測(cè)定等)應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品,應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度,一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。
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