豚鼠標記物(MART/Melan-A) ELISA 試劑盒
供體外研究使用，不用于臨床診斷!
有效期：6個月

保存條件：2-8℃


[實驗原理]
   試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠（Acetyl-Foxo3a）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。


[樣本處理及要求]
1.  血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.  組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。



[需要而未提供的試劑和器材]
1.酶標儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水



[試劑盒組成]



備注：
1.  標準品濃度依次為：600、300、150、75、37.5、18.75 ng/mL
2.  經(jīng)過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過標準品濃度時，可用將標本進行適當稀釋后再進行實驗。



[注意事項]
1.嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2.洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
4.底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。
6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8.任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
9.不能使用過期產(chǎn)品。
10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。



[試劑準備]
從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。



[操作步驟]
1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.  樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。



[實驗結果計算]
以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。



[試劑盒性能]
1. 檢測范圍：18.75 ng/mL – 600 ng/mL。
2. 靈敏度：檢測濃度小于1.0 ng/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
4. 重復性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。



[說明]
1.由于現(xiàn)有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質量技術風險。
2.終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關，請務必準備充足的標本備份。
3.不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。
4.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到佳的檢測結果。
5.本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。
6.使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質的引入導致ELISA實驗結果偏差。
7.若樣本為細胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。
8.某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。

豚鼠標記物(MART/Melan-A) ELISA 試劑盒
ELISA檢測試劑盒承諾
公司長期與各大高校、醫(yī)院及科研單位保持著良好的合作關系，公司的產(chǎn)品質量及服務態(tài)度得到了他們的一致認可。篤瑪生物本著客戶至上的原則為客戶提供優(yōu)質產(chǎn)品，公司承諾產(chǎn)品有任何質量的問題免費包退換（非人為因素造成的）。公司提供免費代測服務，并且承諾收到樣本七個工作日出結果，確保數(shù)據(jù)的準確性。


試驗原理：
本試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知待測物質濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將待測物質和標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中待測物質的濃度呈比例關系。

完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：
（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；
（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；
（3）酶的底物；
（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；
（5）結合物及標本的稀釋液；
（6）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；
（7）酶反應終止液，常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的*終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。


自備材料
1）蒸餾水。
2）加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3）振蕩器及磁力攪拌器等。

試劑盒安全性
1）避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2）實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3）不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

制取抗體應采用什么方法原理？
抗體也是有著多種類型及不同種屬的，制取抗體應選用什么辦法原理？
免疫細胞化學的技能要害之一是制備特異性強、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個抗原決議簇，用它免疫動物將發(fā)生對各個決議簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體免疫球蛋白屬同一類型，質地純一，而且它是針對某一抗原決議簇的，因而特異性強，親合性也共同。



怎么挑選正確的抗體制備技能？
從別離到表達：不同的抗體重組技能能夠用于制備不同的抗體，工業(yè)上和學術界都開展了許多相關的技能，噬菌體展現(xiàn)就是其間的主導技能。昆蟲和哺乳動物細胞的表達體系從理論上而言是類似的，可是其它的分子進化類型需求從頭提煉和別離抗體。
（抗血清質量的評價）
1. 效價
放射免疫法：以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質符號抗原混合，孵育24h后，測定其結合率。一般以結合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000?？寡宓男r，除由抗血清自身的性質決議外，還受符號抗原的質量、孵育時刻，所用稀釋液的成分及其pH等要素的影響，在工作中有必要引起留意。
雙向分散法：使用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上分散，兩者在相交處發(fā)生沉積線，以調查和判別抗血清中是否有抗體及其濃度。
球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，參加，使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在潔凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，凝固后，用打孔器打孔。中心孔內(nèi)加適量抗原，周圍各孔內(nèi)分別參加50μl 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，調查有無沉積線發(fā)生，以判別血清的稀釋度。

2. 特異性測定
    抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應的抗原及近似的抗原物質的辨認能力。特異性好就是抗血清的辨認能力強。一般，特異性是以穿插反響率來表明的。穿插反響率低，表明抗血清的特異性好，反之則特異性差。穿插反響率一般是用競賽按捺曲線來判別的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質分別做競賽按捺曲線，核算各自的結合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式核算穿插反響率。
S=y/Z×100%
S：穿插反響率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質的濃度。
如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質IC50濃度幾乎是無限大，能夠說這一抗血清與其它抗原物質的穿插反響率近似零，即無穿插反響，該抗血清的特異性是好的。

3. 親合力
    在免疫學中，親合力是指抗體與結合抗原體的活度或結實度?？贵w與抗原結合疏松，結合后會敏捷解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的凹凸是由抗原分子的巨細，抗體分子的結合位點與抗原的決議基之間的立體結構型的適宜程度決議的。親合力常以親合常數(shù)K表明。K的單位是升/摩爾。在RIA中，K是該抗血清能到達的小檢出量的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是小檢出量，一般，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達1014L/mol的。
    核算親合常數(shù)的辦法20余種，核算出的K都不能實在反映試驗狀況，只能作為參閱。

試劑盒局限
6號標準品以上的結果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結果。

試劑盒試劑盒性能
1. 靈敏度：小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

冷凍細胞凍結程序

ELISA檢測試劑盒承諾
公司長期與各大高校、醫(yī)院及科研單位保持著良好的合作關系，公司的產(chǎn)品質量及服務態(tài)度得到了他們的一致認可。篤瑪生物本著客戶至上的原則為客戶提供優(yōu)質產(chǎn)品，公司承諾產(chǎn)品有任何質量的問題免費包退換（非人為因素造成的）。公司提供免費代測服務，并且承諾收到樣本七個工作日出結果，確保數(shù)據(jù)的準確性。