豚鼠可溶性血纖蛋白(sFMC) ELISA 試劑盒

用途

       ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，

酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。

用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載體上。

此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，

故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。然而，影響Elisa試驗結(jié)果的因素很多，故加強各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學的優(yōu)點。

ELISA的評估

ELISA Kit的多指標決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項指標進行測定評估，分析如下：

1、準確性

ELISA Kit的多指標決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項指標進行測定評估，分析如下：

a.回收率：測定試劑盒對數(shù)據(jù)真實性的校準，過高或偏低會產(chǎn)生加樣和假性性的失準數(shù)據(jù)。
b.線性：測定試劑盒稀釋液與樣本微環(huán)境的的準確性，過高或偏低均會出現(xiàn)測定的偏差。

2、精確度

a.板內(nèi)精確度：評價單次實驗中，同一個已知濃度不同復孔的差異。
b.板間精確度：評價同一樣本，多次實驗的差異。

3、精密度

檢測限：能顯著區(qū)分空白信號的最小信號值對應的濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。

4、特異性

a.交叉反應：評判特異性，不同分子與試劑盒抗體結(jié)合能力，交叉反應越大，特異性越差。
b.抗干擾能力：同源物的干擾，內(nèi)源性物質(zhì)對檢測系統(tǒng)的干擾。

5.天然樣本檢測性

對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結(jié)果。

6、穩(wěn)定性

試劑盒時效性和穩(wěn)定性是對指標檢測的重要保障。穩(wěn)定性越高，試劑盒存儲時間越久。

ELISA的原理

ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合，檢測過程中，通常使用洗板的方式去除非結(jié)合物，最終酶促反應后的底物的顏色，對樣本中蛋白進行定性與定量。

不按說明書操作會造成的后果

每一個試劑盒里都會有對應的說明書，注意事項里大多都會提到“實驗嚴格按照說明書的操作進行"。為什么要嚴格按照說明書操作？為了更完整的回答這個問題，需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。

根據(jù)試劑的來源和標本的性狀及檢測的具體條件，可設計出不同類型的檢測方法。大致分為以下幾類：

1.雙抗體夾心法測抗原

2.雙抗原夾心法測抗體

3.競爭法測抗原

4.間接法測抗體

總結(jié)如果不按說明書操作可能會出現(xiàn)的不滿意結(jié)果。

A. 先說最嚴重的操作錯誤，看錯或壓根不看試劑盒配套說明書，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當作雙抗體夾心法來做，導致的結(jié)果就是整板顯示很強的藍色，無任何梯度。

B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導致的結(jié)果是，浪費珍貴的樣本，樣品的回收率達不到預期值，如果混用不同試劑盒的酶復合物，會導致顯色過弱或過強，因為每種試劑盒所用酶復合物效價可能不一樣。

C. 不看文獻或者不做預實驗。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻報道推算樣本應該1:10稀釋，結(jié)果稀釋成1:1000，導致的結(jié)果是顯色過弱，結(jié)果不可用。

D. 不校準移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導致工作試劑濃度不準確，孵育溫度不合適，實驗帶來誤差。

E. 洗滌不充分，每孔洗液加樣過少，或者殘留。導致的結(jié)果是顯色過快，同時背景較高。

F. 手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液，導致洗液污染，整個實驗失敗。

G. 剩余酶標板條未及時放入干燥袋，導致酶標板受潮，下一次再做時，顯色過弱或污染，CV值過高。

 ELISA常見主要試劑

1. 抗體：單抗特異性強，多抗結(jié)合性高，試劑盒需要高效的配對。

2. 2.抗原：大多為重組蛋白,細胞因子和待測樣本，高效標準品需NIBSC/WHO校準。

3. 3.顯色作用體系：首先辣根過氧化物酶（HRP）與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系，再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對-磷酸酯可形成黃色底物，還有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高強度熒光。

ELISA試劑盒采樣的準備保證和運輸要求
采樣ELISA試劑盒準備包裝和運輸要求：
1）準備無菌容器、樣品標簽、采樣登記表、記號筆、樣品運輸過程中所需物品(如包裝箱、冷藏設備)等。
2）采集樣品的在樣品采集、運輸、儲存等過程中，應采取必要的措施防止交叉污染和環(huán)境污染及食品中微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化。
3）樣品應在接近原有儲存溫度的條件下傳送，冷凍、冷藏的樣品應能達到規(guī)定溫度，樣品送到實驗室應越快越好，如果路途遙遠，應將不需冷凍的樣品都保存在2℃-5℃環(huán)境中；
4）冷凍產(chǎn)品可以冷凍運輸或者在允許解凍的情況下冷藏運輸，但樣品溫度不得超過 8℃，一旦解凍不得再次冷凍，保持冷卻即可。
ELISA試劑盒為了更好的服務好每一位顧客，始終把產(chǎn)品品質(zhì)和人力資源視為企業(yè)發(fā)展的原動力，“崇尚品質(zhì)，以人為本"，堅決抵制低劣、偽冒產(chǎn)品的不正當競爭。
在注重產(chǎn)品品質(zhì)和人才隊伍的同時也建立了一套、物流、售后服務等服務體系，為您提供快速穩(wěn)定的供應、無可挑剔的質(zhì)量、貼心的服務。

如何保持胚胎干細胞的無線潛能

      胚胎干細胞（ESCs）具有的潛能，其可以轉(zhuǎn)化成為機體任何一種類型的細胞，一旦其開端沿著某一特定的途徑轉(zhuǎn)化成為某種特定的安排，胚胎干細胞就會失掉無限的潛能，如今科學家們嘗試了解這一進程發(fā)作的方法和原因，旨在開發(fā)新型再生療法，即誘導機體本身的細胞替代受損或疾病的器官。

     近日，一項刊登在國際雜志Nature Communications上的研討報告中，來自索爾克研討所的科學家們經(jīng)過研討開發(fā)了一種新型蛋白復合體，其能按捺干細胞的發(fā)展，從而使其可以保持無限的潛能；這種名為GBAF的復合體或有望作為后期科學家們開發(fā)新型再生醫(yī)學療法的潛在靶點。

     研討者Diana Hargreaves教授表明，這項研討中，咱們始于對胚胎干細胞多能性的探究，這種多能性可以促進胚胎干細胞轉(zhuǎn)化成為機體中任何一種類型的細胞，闡明控制干細胞多潛能性的多種基因網(wǎng)絡十分重要，因而可以找到一種在這一調(diào)節(jié)進程中扮演關鍵角色的不知道蛋白，關于研討者而言也是十分有意義的。機體中的每一個細胞都有著相同的一套DNA元件，其包括有制作每一種可能性細胞類型的指令；大型的蛋白復合體（染色質(zhì)重塑器）可以激活或沉默基因的表達，輔導胚胎干細胞進入到一種特殊的途徑中，就比如一群計劃裝修房子的承包商們，這些蛋復合體也包括有多重亞單位，不同亞單位的組合就可以改動DNA的物理形狀，而且決定哪些基因可以指揮干細胞分解成為肺部細胞或大腦細胞。

     文章中，研討人員想經(jīng)過研討深入了解這些亞單位的集合方法以及特殊的亞單位如何指揮蛋白復合體的功用，因而研討人員轉(zhuǎn)向?qū)σ环N名為BRD9的蛋白進行研討，該蛋白與BAF染色質(zhì)重塑器家族有關，他們估測該蛋白或是其中的一種亞單位；隨后研討者將BRD9化學按捺劑應用于胚胎干細胞中，并進行了一系列實驗來全面剖析與BAF復合體活性改動相關的細胞多潛能性。
研討者發(fā)現(xiàn)，BRD9能扮演胚胎干細胞發(fā)育制動器的角色，當BRD9開端發(fā)揮作用時，細胞就會保持多潛能性，而當BRD9的活性被按捺時，細胞就會開端發(fā)育的下一個階段，隨后研討者鑒別出了哪種BAF復合體能在細胞中發(fā)揮作用，結(jié)果表明，BRD9或許是一種不知道BAF復合體的一部分。

豚鼠可溶性血纖蛋白(sFMC) ELISA 試劑盒

 2、精確度

a.板內(nèi)精確度：評價單次實驗中，同一個已知濃度不同復孔的差異。

b.板間精確度：評價同一樣本，多次實驗的差異。

3、精密度

檢測限：能顯著區(qū)分空白信號的最小信號值對應的濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。

 4、特異性

a.交叉反應：評判特異性，不同分子與試劑盒抗體結(jié)合能力，交叉反應越大，特異性越差。

b.抗干擾能力：同源物的干擾，內(nèi)源性物質(zhì)對檢測系統(tǒng)的干擾。

 5.天然樣本檢測性

對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結(jié)果。

 6、穩(wěn)定性

試劑盒時效性和穩(wěn)定性是對指標檢測的重要保障。穩(wěn)定性越高，試劑盒存儲時間越久。

ELISA的應用

ELISA技術(shù)是特定靶標蛋白質(zhì)定量的金標準，提供快速，穩(wěn)定且易于分析的結(jié)果。可以對生物大分子/小分子的定量，對親和力測定評價或者篩選，還可對重組蛋白或細胞因子進行活性比對分析等運用。常應用于細胞因子，趨化因子，生長因子等檢測，同時應用于癌癥、干細胞、免疫學、神經(jīng)學和信號轉(zhuǎn)導等研究領域的靶標。

ELISA實驗所用試劑-酶的底物與最后步驟詳解介紹！

1，酶的底物

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HRP的底物

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HRP催化過氧化物的氧化反應，代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O

　　上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

　OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。

　　TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。

ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

　　另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于ELISA的優(yōu)點為可加寬定量測定的線性范圍。

　　HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。

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AP的底物

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　　AP為磷酸酯酶，一般采用對磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。

2，洗滌液

　　在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

3，　酶反應終止液

　　常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

4，陽性對照品和陰性對照品

　　陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。

例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可對標本中受檢物質(zhì)的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

5，參考標準品

　　定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。