豚鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH) ELISA 試劑盒

一、實(shí)驗(yàn)原理

 ELISA 試劑盒ELISA試劑盒是一種基于酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）的試劑盒，用于定量檢測人血清、血漿或組織勻漿中的 濃度。本試劑盒采用高特異性的抗體捕獲抗原，并通過酶標(biāo)板檢測系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)將詳細(xì)介紹該試劑盒的操作步驟。

1、效價(jià)
      放射免疫法：以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)符號(hào)抗原混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率。一般以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價(jià)。如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為1：15000，則該血清的效價(jià)就是1：15000?？寡宓男r(jià)，除由抗血清自身的性質(zhì)決議外，還受符號(hào)抗原的質(zhì)量、孵育時(shí)刻，所用稀釋液的成分及其pH等要素的影響，在工作中有必要引起留意。
       雙向分散法：使用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上分散，兩者在相交處發(fā)生沉積線，以調(diào)查和判別抗血清中是否有抗體及其濃度。
球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時(shí)，參加，使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在潔凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，凝固后，用打孔器打孔。中心孔內(nèi)加適量抗原，周圍各孔內(nèi)分別參加50μl 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，調(diào)查有無沉積線發(fā)生，以判別血清的稀釋度。

2. 特異性測定
     抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對(duì)相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的辨認(rèn)能力。特異性好就是抗血清的辨認(rèn)能力強(qiáng)。一般，特異性是以穿插反響率來表明的。穿插反響率低，表明抗血清的特異性好，反之則特異性差。穿插反響率一般是用競賽按捺曲線來判別的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競賽按捺曲線，核算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時(shí)的濃度，按下列公式核算穿插反響率。
       S=y/Z×100%
    S：穿插反響率，y：IC50時(shí)抗原濃度，Z：IC50時(shí)近似抗原物質(zhì)的濃度。
如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無限大，能夠說這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的穿插反響率近似零，即無穿插反響，該抗血清的特異性是好的。

3. 親合力
     在免疫學(xué)中，親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或結(jié)實(shí)度?？贵w與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會(huì)敏捷解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的凹凸是由抗原分子的巨細(xì)，抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原的決議基之間的立體結(jié)構(gòu)型的適宜程度決議的。親合力常以親合常數(shù)K表明。K的單位是升/摩爾。在RIA中，K是該抗血清能到達(dá)的最小檢出量的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，一般，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達(dá)1014L/mol的。
核算親合常數(shù)的辦法20余種，核算出的K都不能實(shí)在反映試驗(yàn)狀況，只能作為參閱。

冷凍細(xì)胞凍結(jié)程序:

2.1. 根據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單之基礎(chǔ)培育基品種、血清品種和其它之成份和份額，制備培育基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無法當(dāng)即習(xí)慣不同之基礎(chǔ)培育基或不同之血清品種，若因試驗(yàn)需要，有必要有所不同時(shí)，必須以緩慢份額逐步改動(dòng)培育基組成，斷定細(xì)胞習(xí)慣后，方進(jìn)行所需之試驗(yàn)。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)必須根據(jù)細(xì)胞株資料單之血清品種培育之。

將培育基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦洗之，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管，當(dāng)即放入37 °C 水槽中快速凍結(jié)，水面高度不行挨近或高過冷凍管之蓋沿，不然易發(fā)作污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后，以70 % ethanol 擦洗冷凍管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。

根據(jù)細(xì)胞品種和濃度，于無菌操作臺(tái)內(nèi)取10 ml 培育基加至T25 或T75 flask中。取出已凍結(jié)之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培育基，混合均勻，放入37 °C，5 % CO2 培育箱培育。

四、結(jié)果分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出樣本中兔轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR/CD71) 的濃度。具體分析方法可參考試劑盒說明書或相關(guān)文獻(xiàn)。

五、注意事項(xiàng)

1. 在操作過程中，應(yīng)保持酶標(biāo)板的干燥，避免水分進(jìn)入孔內(nèi)。
2. 加樣時(shí)需確保加樣準(zhǔn)確、無氣泡產(chǎn)生。
3. 溫育和洗滌過程中需嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4. 在使用酶標(biāo)儀讀取OD值時(shí)，需確保波長設(shè)置正確，避免誤差產(chǎn)生。
5. 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，需保持操作環(huán)境的清潔和整潔，避免交叉污染。

如何處理ELISA測定抗體疫苗之實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

在ELISA試劑盒試驗(yàn)中我們總是碰到許多關(guān)于數(shù)據(jù)處理的難題，為了能我們更多更具體的了解在試驗(yàn)中數(shù)據(jù)處理的問題，下面一起來看看ELISA測定抗體之怎么處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

ELISA做得很好的話批間CV都要有10～15％左右，用同一個(gè)抗原，但對(duì)于包被的抗原濃度對(duì)OD的影響不是很大，只要不是不同太大即可。抗血清當(dāng)然要用同一個(gè)稀釋度了。別的比較的話就必每批，每塊板上的樣品都要伴隨著一個(gè)參比品一同做，參比品仍是同一個(gè)這樣才干確保試驗(yàn)成果的可比性。

剖析：

（1）將同一只動(dòng)物免疫不同時(shí)刻后抗體產(chǎn)生的效價(jià)進(jìn)行比較。

（2）由上面能夠得出一組數(shù)據(jù)，舉個(gè)比如即如某個(gè)免疫間期抗體升高2倍的有多少，升高4，8，16...的各有多少，然后可知大多數(shù)情況下可升高多少，即此種升高率的陽性率，然后再用泊松散布證明此陽性率是否贊同整體在這個(gè)免疫間期增高的陽性率，仍是由于隨機(jī)誤差的原因使試驗(yàn)得到了這個(gè)成果。

（3）計(jì)算出不同間期的效價(jià)水平后，能夠用方差剖析進(jìn)行整體比較，證明不同間期免疫的作用差異是否有計(jì)算學(xué)含義；然后再兩兩之間進(jìn)行比較，看免疫作用*顯著的是哪個(gè)間期。

怎樣體現(xiàn)試驗(yàn)成果？

1、文字?jǐn)⒄f：依據(jù)試驗(yàn)意圖將原始資料系統(tǒng)化、條理化，用精確的專業(yè)術(shù)語客觀地描繪試驗(yàn)現(xiàn)象和成果，要有時(shí)刻次序以及各項(xiàng)目標(biāo)在時(shí)刻上的聯(lián)系。

2、圖表：用表格或坐標(biāo)圖的方法使試驗(yàn)成果杰出、明晰，便于彼此比較，尤其適合于分組較多，且各組調(diào)查目標(biāo)一致的試驗(yàn)，使組間異同一望而知。每一圖表應(yīng)有表目和計(jì)量單位，應(yīng)闡明必定的中心問題。

3、曲線圖：使用記載儀器描記出的曲線圖，這些目標(biāo)的變化趨勢形象生動(dòng)、直觀明了。在試驗(yàn)陳述中，可任選其間一種或幾種辦法并用，以取得最佳作用。

ELISA實(shí)驗(yàn)的加樣原理是什么？
  ELISA是免疫學(xué)中常用檢測辦法，在ELISA試驗(yàn)進(jìn)程中加樣也是極為重要的步驟之一。今日，酶聯(lián)生物將為廣大科研朋友解說ELISA試劑盒試驗(yàn)加樣的原理，以供咱們參閱：
正確的加樣辦法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁參加，應(yīng)留意視點(diǎn)太小，會(huì)使液體殘留在孔壁上，導(dǎo)致加樣不精確；吸頭應(yīng)當(dāng)貼著管壁和液面的交界處！
要留意防止呈現(xiàn)嚴(yán)峻溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有相似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育進(jìn)程中吸附于固相，然后與后邊參加的HRP底物反響顯色。
血清標(biāo)本如是以無菌操作別離，則可以在2～8 ℃下保存一周，如為有菌操作，則主張冰凍保存。樣本的長時(shí)間保存，應(yīng)在-70 ℃以下。樣本的收集及血清別離中要留意盡量防止細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的成長，其所排泄的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白發(fā)生分化效果；二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定辦法發(fā)生非特異性干擾。標(biāo)本在保存中如呈現(xiàn)細(xì)菌污染所形成的的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉積后取上清檢測。冰凍保存的血清標(biāo)本須留意防止因停電等形成的重復(fù)凍融。標(biāo)本的重復(fù)凍融所發(fā)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子發(fā)生損壞效果，然后引起假陰性成果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)留意，不要進(jìn)行劇烈振動(dòng)，重復(fù)倒置混勻即可。

豚鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH) ELISA 試劑盒

ELISA試劑盒運(yùn)用應(yīng)當(dāng)留心哪些事項(xiàng)

1、ELISA試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可運(yùn)用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2、濃洗刷液可能會(huì)有結(jié)晶分出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗刷時(shí)不影響效果。

3、各步加樣均應(yīng)運(yùn)用加樣器，并常常校正其準(zhǔn)確性，以避免實(shí)驗(yàn)過失。一次加樣時(shí)刻最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，舉薦運(yùn)用排槍加樣。

4、請(qǐng)每次測定的一同做規(guī)范曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于規(guī)范品孔孔OD值的)，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋必定倍數(shù)(n倍)后再測定，核算時(shí)請(qǐng)最終乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。

5、嚴(yán)格按說明書的操作進(jìn)行，ELISA試劑盒效果判定有必要以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

6、本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

7、封板膜只限一次性運(yùn)用，以避免穿插污染。

8、悉數(shù)樣品，洗刷液和各種廢棄物都應(yīng)按感染物處理。

9、底物請(qǐng)避光保存。

血清在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中起的作用

A 供應(yīng)細(xì)胞生計(jì)和增殖所必需的生長調(diào)理因子。

B 補(bǔ)償根底培養(yǎng)基中沒有或量缺少的營養(yǎng)成分。

C 富含一些可供貼壁細(xì)胞型細(xì)胞貼壁生長的基質(zhì)成分。

D 供應(yīng)載體蛋白，可聯(lián)絡(luò)維生素、脂質(zhì)、金屬離子等。

E 在一些情況下，中和毒性物質(zhì)維護(hù)細(xì)胞不受損害。

F 給培養(yǎng)液供應(yīng)出色的緩沖系統(tǒng)。

G 供應(yīng)蛋白酶克制劑，維護(hù)細(xì)胞免受死細(xì)胞開釋的蛋白酶的損害。

血清也存在一些害處，比如存在不少有害成分（補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長克制因子等）；血清成分不明確，影響對(duì)效果的分析；不一樣動(dòng)物、不一樣批次的血清成分和活性有很大不一樣，使得培養(yǎng)效果不穩(wěn)定。盡管如此，血清仍然是培養(yǎng)液中最根本的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或細(xì)胞生長情況不良時(shí)，常常會(huì)先運(yùn)用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛后再換成無血清培養(yǎng)液。

血清中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其間蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白。氨基酸有多種，是細(xì)胞組成蛋白質(zhì)的根本成分，其間有些氨基酸動(dòng)物細(xì)胞本身不能組成（稱為必需氨基酸），必須由培養(yǎng)液供應(yīng)。血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子（如表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、類胰島素生長因子等）；血清還富含多種不知道的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能推進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和貼附。因此，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要保證細(xì)胞可以順利生長和增殖，一般需添加10%～20%的血清，動(dòng)物血清還可起到酸堿度緩沖液的作用。

抗體技術(shù)規(guī)格