豚鼠甲狀旁腺激素樣蛋白(PLP) ELISA 試劑盒 

試劑盒局限

6號標準品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結(jié)果。

試劑盒性能

1. 靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應。

3. 重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

如何保證ELISA試劑盒的質(zhì)量

一、辦法學的影響

ELISA測定模式包含以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競賽抑制法，其中競賽抑制法(HBeAb,HBcAb等采用)因受操作時差所引起的平競賽等要素的影響，成果重復性較差，質(zhì)量較難控制。

二、試劑要素

不同批次的ELISA試劑在制造進程中很難確保質(zhì)量一致，即使是經(jīng)過批批檢的項目其檢測成果也存在差異，因而必須選擇和訂貨長批號的試劑，并確保保存條件。嚴厲執(zhí)行這一規(guī)范可以防止因試劑批號改動而從頭樹立質(zhì)控系統(tǒng)及從頭評估試劑的雜亂進程，并且可以確保成果的穩(wěn)定性；對于效期短、使用率低的試劑，應當小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，防止重復凍融造成試劑的失效。

三、樣本要素

標本攪擾要素包含內(nèi)源性攪擾要素和外源性攪擾要素，ELISA試劑盒前者包含類風濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、等，后者包含標本溶血、標本被細菌污染、標本儲存時間過長、標本凝結(jié)不全、冷凍標本的重復凍融等。

四、操作要素

ELISA操作步驟雜亂，操作不當將引起較大的誤差。加樣、溫育、洗滌、顯色、比色。

五、灰區(qū)的設(shè)置

通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性"和“陰性"來陳述成果，兩者間有一條分界線被稱為

“陽性判斷值"(cut-off value，CO值)，這是定性免疫測定成果陳述的依據(jù)。

六、標本復查

ELISA手工檢測進程雜亂，影響要素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成成果的差異，因而加大復查力度是確保成果準確性的牢靠辦法，比如對HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項目的可疑、弱陽性標本及罕見模式的檢測成果進行復查。

七、常表明成果的常用辦法

1.定性測定

2.半定量測定 成果一般以滴度表明。

3.定量測定 即用已知量的規(guī)范品作一系列稀釋后進行ELISA測定，制作規(guī)范曲線，成果以jue對量或單位表明。在ELISA試劑盒定量檢測中每一塊反應板都必須制作相應的規(guī)范曲線。

不按說明書操作會造成的后果

每一個試劑盒里都會有對應的說明書，注意事項里大多都會提到“實驗嚴格按照說明書的操作進行"。為什么要嚴格按照說明書操作？為了更完整的回答這個問題，需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。

根據(jù)試劑的來源和標本的性狀及檢測的具體條件，可設(shè)計出不同類型的檢測方法。大致分為以下幾類：

1.雙抗體夾心法測抗原

2.雙抗原夾心法測抗體

3.競爭法測抗原

4.間接法測抗體

總結(jié)如果不按說明書操作可能會出現(xiàn)的不滿意結(jié)果。

A. 先說最嚴重的操作錯誤，看錯或壓根不看試劑盒配套說明書，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當作雙抗體夾心法來做，導致的結(jié)果就是整板顯示很強的藍色，無任何梯度。

B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導致的結(jié)果是，浪費珍貴的樣本，樣品的回收率達不到預期值，如果混用不同試劑盒的酶復合物，會導致顯色過弱或過強，因為每種試劑盒所用酶復合物效價可能不一樣。

C. 不看文獻或者不做預實驗。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻報道推算樣本應該1:10稀釋，結(jié)果稀釋成1:1000，導致的結(jié)果是顯色過弱，結(jié)果不可用。

D. 不校準移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導致工作試劑濃度不準確，孵育溫度不合適，實驗帶來誤差。

E. 洗滌不充分，每孔洗液加樣過少，或者殘留。導致的結(jié)果是顯色過快，同時背景較高。

F. 手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液，導致洗液污染，整個實驗失敗。

G. 剩余酶標板條未及時放入干燥袋，導致酶標板受潮，下一次再做時，顯色過弱或污染，CV值過高。

怎么挑選適合自己實驗的抗體

一、關(guān)于特異性的挑選：

特異性的挑選首要需求考慮四個方面：蛋白特異性、種屬特異性、試驗方法特異性、符號物的特異性。

1、蛋白特異性：

針對需求檢測的蛋白查找抗體，幾個細節(jié)要區(qū)分，重組表達的蛋白和內(nèi)源性蛋白的檢測，對抗體的要求是不一樣的，注意檢查抗體說明書的檢測說明。假如重組蛋白不是全長表達，則需求注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。

內(nèi)源性蛋白能清楚其剪切與潤飾的方式，特殊表型的蛋白需求進行序列比對，并結(jié)合抗體免疫原序列，檢查穿插反應的狀況。磷酸化蛋白檢測需求確認具體位點，不同位點的磷酸化意味著或許有不同的機制存在，不宜混為一談。

2、種屬特異性：

同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或規(guī)劃多肽抗原的，根據(jù)蛋白的同源性狀況與其他種屬發(fā)生穿插反應。需求參照說明書注明的可反應種屬信息。

一些稀有種屬很難找到抗體，可以經(jīng)過蛋白的序列比對，挑選同源序列免疫的抗體，不過一般這種狀況生產(chǎn)商不會受理其關(guān)于質(zhì)量的申述，假如可以申請到免費的抗體樣品，則利于抗體挑選。。

3、符號物的特異性

一般基于試驗操作的試驗方法不會運用帶有符號的一抗，比方WB、IHC等，都是經(jīng)過二抗類的試劑符號達到成果出現(xiàn)的意圖?？墒腔趦x器剖析的一些試驗，或許就會運用到直接符號的一抗，比方流式試驗。那么需求了解到自己將要運用的儀器能檢測到的熒光規(guī)模，針對不通的參數(shù)要求挑選對應的符號物。在免疫熒光雙標試驗中，需求選配不同的熒光符號物。

二、抗體種屬來歷的挑選：

有人以為單抗比多抗好，其實這并不是一個嚴謹?shù)挠^點，只能說在或許性上單抗的特異性更好一些，而多抗的親和力會優(yōu)于單抗，而且特異性并不一定就遜于單抗，首要看抗原的規(guī)劃水平。

目前商品化抗體里單抗首要是鼠單抗、兔單抗，多抗首要是兔多抗、山羊多抗等，其他種屬來歷抗體較少。不主張糾結(jié)于單抗好還是多抗好，能做出試驗的抗體便是好抗體。

在挑選上一般主張試驗種屬和抗體種屬親緣性越遠越好，不宜同源?？贵w不同種屬會要影響接下來二抗的選配。特別是在免疫熒光雙標試驗中，需求在差異于試驗種屬的基礎(chǔ)上，區(qū)分開兩個目標的抗體種屬來歷，以便于二抗差異識別。

三、關(guān)于品牌的挑選：

由于抗體品質(zhì)的異質(zhì)化，關(guān)于抗體的品牌挑選就被我們所注重，可是不管是什么品牌都難免會遇到不合適自己試驗的抗體。所以一般主張考慮那些業(yè)界普遍認可、購買方便、專業(yè)、售后處理快捷的品牌。

一些乃至都沒有正式代理的，只能備選。一起購買時一定要找可以供給產(chǎn)品指導、試驗剖析、售后處理的正規(guī)代理商購買，防止由于買到假貨水貨影響試驗。

其實或許只是生產(chǎn)商只檢測時運用了不同的種屬不同的樣品類型，或是參照了不同的文獻，對運用者來說，相同的樣品，不管運用哪個品牌的，只需抗體是對的，意圖條帶只會出現(xiàn)在相同的位置。

ELISA試劑盒技術(shù)流程

技術(shù)提示：

1、混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結(jié)果準確性的必要條件。

4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產(chǎn)物，會瞬間變?yōu)辄S色。

6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

8、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。

試劑盒性能：

1. 樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。

2. 批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應分別小于10%和15% 。

操作注意事項

1）試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

2）實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

3）不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

4）使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5）使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6）洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

7）底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

8）加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

9）按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

試劑盒試劑的準備

1）標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。

2）洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

試劑盒操作步驟

1）使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2）根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內(nèi)。

3）加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)。立即加入50ul的標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

4）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

8）取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結(jié)果。

9）在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷與分析

1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的待測物質(zhì)標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的待測物質(zhì)含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

豚鼠甲狀旁腺激素樣蛋白(PLP) ELISA 試劑盒

本試劑供研究使用      

實驗目的：

本試劑盒可用于測定血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液等

試劑盒常見處理方法
1、血清(漿)樣品:直接檢測。
2、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量
(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議 500萬細菌或細胞加入 1mL提取液) ,超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲 3s,間隔10s,重復30 次)8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g) :提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g組織,
加入 1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

自備材料

1）蒸餾水。

2）加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3）振蕩器及磁力攪拌器等。

試劑盒安全性

1）避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2）實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3）不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

客戶須知
1. 收到試劑盒后請按照產(chǎn)品說明書“組成試劑和配制試劑"核對試劑種類和數(shù)量,注意是否漏液,妥善存放不同試劑。
2. 檢測前按照說明書“自備儀器和試劑用品"準備好相應儀器和試劑。
3. 測定前務必認真閱讀說明書,嚴格按照說明書要求操作,以保證檢測結(jié)果可靠。
4. 建議選2個樣品做預測定,以免浪費樣品和試劑盒。有問題請及時全面如實地與售后溝通,以找到真正的原因,確保實驗順利進行。
5. 試劑盒質(zhì)量本身負責,對于因用戶的樣品、保存和操作等公司無法控制的因素造成測定失敗,不能負責。

試劑盒組成：

血清總鐵結(jié)合力是指血清鐵蛋白，血清總鐵結(jié)合力是血清鐵蛋白的主要部分，是判斷機體鐵儲量是否充足的特異性指標。總鐵結(jié)合力的正常值為11.1-16.6g/L，血清總鐵結(jié)合力偏低常見于缺鐵性貧血、失血性貧血、鐵粒幼細胞性貧血等。

1、 缺鐵性貧血：主要是由于鐵攝入不足、鐵吸收障礙或鐵丟失過多等原因，導致體內(nèi)儲存鐵耗盡，血清鐵蛋白降低，可出現(xiàn)面色蒼白、頭暈眼花、胸悶、乏力等癥狀。如果是由于缺鐵性貧血導致，建議遵醫(yī)囑給予等藥物進行治療;

2、 失血性貧血：主要是由于外傷、手術(shù)等導致機體大量失血，鐵丟失過多，血清鐵蛋白降低，可出現(xiàn)皮膚蒼白、頭暈、心悸、胸悶等癥狀。建議遵醫(yī)囑給予輸血治療，同時也應給予鐵劑進行補充，如、等;

3、 鐵粒幼細胞性貧血：是由于鐵代謝異常、鐵儲量增加、鐵利用障礙等，導致紅細胞內(nèi)鐵缺乏，血清鐵蛋白升高，可出現(xiàn)皮膚蒼白、乏力、頭暈等癥狀。建議遵醫(yī)囑給予維生素B12、等藥物進行治療;

4、 其他：如溶血性貧血、鐵粒幼細胞性貧血、巨幼細胞性貧血等，都可以導致血清總鐵結(jié)合力降低，建議及時就醫(yī)，進行相關(guān)檢查，明確診斷，在醫(yī)生的指導下給予治療。

另外，鐵結(jié)合力是判斷人體鐵儲量是否充足的特異性指標，但并不能反映鐵的消耗量或者吸收量。通常需要結(jié)合總鐵結(jié)合力和轉(zhuǎn)鐵蛋白含量等其他指標，以及血常規(guī)中其他指標進行綜合判斷。

熒光分析法

熒光分析法是指利用某些物質(zhì)被紫外光照射后處于激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子經(jīng)歷一個碰撞及發(fā)射的去激發(fā)過程所發(fā)生的能反映出該物質(zhì)特性的熒光，可以進行定性或定量分析的方法。由于有些物質(zhì)本身不發(fā)射熒光（或熒光很弱），這就需要把不發(fā)射熒光的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成能發(fā)射熒光的物質(zhì)。例如用某些試劑（如熒光染料），使其與不發(fā)射熒光的物質(zhì)生成絡(luò)合物，各種絡(luò)合物能發(fā)射熒光，再進行測定。因此熒光試劑的使用，對一些原來不發(fā)熒光的無機物質(zhì)和有機物質(zhì)進行熒光分析打開了大門，擴展了分析的范圍。

特點：靈敏度更高

g/ml，應用不如UV廣泛。

應用：①直接熒光光度法

②作為HPLC的檢測器（用的多）

根據(jù)物質(zhì)分子吸收光譜和熒光光譜能級躍遷機理，具有吸收光子能力的物質(zhì)在特定波長光（如紫外光）照射下可在瞬間發(fā)射出比激發(fā)光波長長的光，即熒光。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

冷原子熒光法檢測汞的原理：

水樣中的汞離子被還原劑還原為單質(zhì)汞，形成汞蒸氣。其基態(tài)汞原子受到波長253.7nm?的紫外光激發(fā)，當激發(fā)態(tài)汞原子去激發(fā)時便輻射出相同波長的熒光。在給定的條件下和較低的濃度范圍內(nèi)，熒光強度與汞的濃度成正比。

冷原子熒光法檢測汞的實驗步驟：

1.試樣制備

將新采水樣充分搖勻后，立即準確吸取10mL，注入10mL?具塞比色管中；?

比色管中加入0.1mL?濃?(用滴管加4?滴)、?0.1mL?溶液?(用滴管加1-2?滴，以能保持水樣呈紫紅色為準)，如果不能至少在15min?維持紫色，則混合后再補加適量溶液，以使顏色維持紫色。加塞搖勻，置金屬架上，放于專用烘箱內(nèi)，在比色管上加一個瓷盤蓋，防止水樣受熱管塞跳出，于105℃消化1h，取出冷卻。?

臨近測定時，邊搖邊滴加0.05mL鹽酸羥胺溶液(3.8)，搖動直至剛好將過剩的剛好褪色為止。取1.0mL上機測定。?

2.測定