牛乙Ⅰ(GLO1)檢測(cè)試劑盒

本試劑僅供研究使用      

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>

本試劑盒用于測(cè)定人血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中白介素6(IL-6)的含量。

實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人白介素6(IL-6)水平。用純化的白介素6(IL-6)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入白介素6(IL-6)，再與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白介素6(IL-6)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中白介素6(IL-6)含量。

試劑盒組成：

應(yīng)用

用于阻斷能受體對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成的影響研究

普萘洛爾、酚妥拉明抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成目的研究離體情況下,p-AR阻斷劑普萘洛爾、a-AR阻斷劑酚妥拉明對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2表達(dá)的影響。

方法1.細(xì)胞免疫熒光鑒定內(nèi)皮細(xì)胞：細(xì)胞采用免疫熒光染色Ⅷ因子進(jìn)行鑒定。將人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于24孔板爬片。待細(xì)胞融合至80%-90%時(shí),4%冰固定20分鐘,0.2%Triton X-100通透10分鐘,羊血清封閉30分鐘。兔多克隆Ⅷ因子（vWF）一抗4℃濕盒內(nèi)過(guò)夜。TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育2小時(shí)（避光）。Hochest（1μg/ml）染核15分鐘（避光）后10%甘油封片。正置熒光顯微鏡下觀察、拍片（×200倍）。

2. Western blot檢測(cè)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞a-AR的表達(dá)：未經(jīng)藥物處理的人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)裂解獲得總蛋白。BCA定量,沸水滅活。取總蛋白約40μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%BSA封閉1小時(shí),蛋白樣品分別在4℃冰箱孵育兔多克隆抗α1-AR、α2-AR一抗過(guò)夜。次日在37℃孵箱中孵育相應(yīng)的二抗1h。采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色,于暗室內(nèi)壓片,顯影定影。

3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞種植于96孔板,將不同濃度梯度的普萘洛爾（0,25,50,75,100μM）、酚妥拉明（0,10,30,50,70μg/ml）分別處理細(xì)胞48h。然后每孔加入10μlCCK-8,孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h。之后于酶標(biāo)儀測(cè)450nm下吸光度值。

怎么挑選適合自己實(shí)驗(yàn)的抗體

一、關(guān)于特異性的挑選：

     特異性的挑選首要需求考慮四個(gè)方面：蛋白特異性、種屬特異性、試驗(yàn)方法特異性、符號(hào)物的特異性。

1、蛋白特異性：

     針對(duì)需求檢測(cè)的蛋白查找抗體，幾個(gè)細(xì)節(jié)要區(qū)分，重組表達(dá)的蛋白和內(nèi)源性蛋白的檢測(cè)，對(duì)抗體的要求是不一樣的，注意檢查抗體說(shuō)明書(shū)的檢測(cè)說(shuō)明。假如重組蛋白不是全長(zhǎng)表達(dá)，則需求注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。

內(nèi)源性蛋白能清楚其剪切與潤(rùn)飾的方式，特殊表型的蛋白需求進(jìn)行序列比對(duì)，并結(jié)合抗體免疫原序列，檢查穿插反應(yīng)的狀況。磷酸化蛋白檢測(cè)需求確認(rèn)具體位點(diǎn)，不同位點(diǎn)的磷酸化意味著或許有不同的機(jī)制存在，不宜混為一談。

2、種屬特異性：

     同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或規(guī)劃多肽抗原的，根據(jù)蛋白的同源性狀況與其他種屬發(fā)生穿插反應(yīng)。需求參照說(shuō)明書(shū)注明的可反應(yīng)種屬信息。

一些稀有種屬很難找到抗體，可以經(jīng)過(guò)蛋白的序列比對(duì)，挑選同源序列免疫的抗體，不過(guò)一般這種狀況生產(chǎn)商不會(huì)受理其關(guān)于質(zhì)量的申述，假如可以申請(qǐng)到免費(fèi)的抗體樣品，則利于抗體挑選。。

3、符號(hào)物的特異性

     一般基于試驗(yàn)操作的試驗(yàn)方法不會(huì)運(yùn)用帶有符號(hào)的一抗，比方WB、IHC等，都是經(jīng)過(guò)二抗類(lèi)的試劑符號(hào)達(dá)到成果出現(xiàn)的意圖?？墒腔趦x器剖析的一些試驗(yàn)，或許就會(huì)運(yùn)用到直接符號(hào)的一抗，比方流式試驗(yàn)。那么需求了解到自己將要運(yùn)用的儀器能檢測(cè)到的熒光規(guī)模，針對(duì)不通的參數(shù)要求挑選對(duì)應(yīng)的符號(hào)物。在免疫熒光雙標(biāo)試驗(yàn)中，需求選配不同的熒光符號(hào)物。

二、抗體種屬來(lái)歷的挑選：

     有人以為單抗比多抗好，其實(shí)這并不是一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠^點(diǎn)，只能說(shuō)在或許性上單抗的特異性更好一些，而多抗的親和力會(huì)優(yōu)于單抗，而且特異性并不一定就遜于單抗，首要看抗原的規(guī)劃水平。

     目前商品化抗體里單抗首要是鼠單抗、兔單抗，多抗首要是兔多抗、山羊多抗等，其他種屬來(lái)歷抗體較少。不主張糾結(jié)于單抗好還是多抗好，能做出試驗(yàn)的抗體便是好抗體。

     在挑選上一般主張?jiān)囼?yàn)種屬和抗體種屬親緣性越遠(yuǎn)越好，不宜同源?？贵w不同種屬會(huì)要影響接下來(lái)二抗的選配。特別是在免疫熒光雙標(biāo)試驗(yàn)中，需求在差異于試驗(yàn)種屬的基礎(chǔ)上，區(qū)分開(kāi)兩個(gè)目標(biāo)的抗體種屬來(lái)歷，以便于二抗差異識(shí)別。

三、關(guān)于品牌的挑選：

     由于抗體品質(zhì)的異質(zhì)化，關(guān)于抗體的品牌挑選就被我們所注重，可是不管是什么品牌都難免會(huì)遇到不合適自己試驗(yàn)的抗體。所以一般主張考慮那些業(yè)界普遍認(rèn)可、購(gòu)買(mǎi)方便、專(zhuān)業(yè)、售后處理快捷的品牌。

     一些乃至都沒(méi)有正式代理的，只能備選。一起購(gòu)買(mǎi)時(shí)一定要找可以供給產(chǎn)品指導(dǎo)、試驗(yàn)剖析、售后處理的正規(guī)代理商購(gòu)買(mǎi)，防止由于買(mǎi)到假貨水貨影響試驗(yàn)。

其實(shí)或許只是生產(chǎn)商只檢測(cè)時(shí)運(yùn)用了不同的種屬不同的樣品類(lèi)型，或是參照了不同的文獻(xiàn)，對(duì)運(yùn)用者來(lái)說(shuō)，相同的樣品，不管運(yùn)用哪個(gè)品牌的，只需抗體是對(duì)的，意圖條帶只會(huì)出現(xiàn)在相同的位置。

牛乙Ⅰ(GLO1)檢測(cè)試劑盒  

計(jì)算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)：

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。

2. 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物請(qǐng)避光保存。

7. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9. 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

ELISA試劑盒運(yùn)用應(yīng)當(dāng)留心哪些事項(xiàng)
1、ELISA試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可運(yùn)用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2、濃洗刷液可能會(huì)有結(jié)晶分出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗刷時(shí)不影響效果。
3、各步加樣均應(yīng)運(yùn)用加樣器，并常常校正其準(zhǔn)確性，以避免實(shí)驗(yàn)過(guò)失。一次加樣時(shí)刻最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，舉薦運(yùn)用排槍加樣。
4、請(qǐng)每次測(cè)定的一同做規(guī)范曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD值大于規(guī)范品孔孔OD值的)，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋必定倍數(shù)(n倍)后再測(cè)定，核算時(shí)請(qǐng)最終乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
5、嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，ELISA試劑盒效果判定有必要以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
6、本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
7、封板膜只限一次性運(yùn)用，以避免穿插污染。
8、悉數(shù)樣品，洗刷液和各種廢棄物都應(yīng)按感染物處理。
9、底物請(qǐng)避光保存。

技術(shù)提示：

1、混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡。

2、加校準(zhǔn)品與樣本時(shí)，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。

4、底物溶液為無(wú)色液體，保存過(guò)程中變?yōu)樗{(lán)色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會(huì)瞬間變?yōu)辄S色。

6、實(shí)驗(yàn)中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

8、檢測(cè)必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。

試劑盒性能：

1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。

2. 批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% 。

抗體的保質(zhì)期與儲(chǔ)存溫度相關(guān)嗎
作為各類(lèi)種屬的高質(zhì)量血清供應(yīng)商，一般客戶(hù)咨詢(xún)血清購(gòu)買(mǎi)時(shí)，我們都會(huì)推薦牛血清。而我公司zui為熱銷(xiāo)的血清產(chǎn)品中莫過(guò)于胎牛血清了，那么為何牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中如此受寵呢？據(jù)酶聯(lián)生物技術(shù)員分析，主要原因有這五個(gè)方面：
1. 提供結(jié)合蛋白：作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用。
2. 提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。
3. 提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生等是細(xì)胞生長(zhǎng)必須的物質(zhì)。
4. 提供激素和各種生長(zhǎng)因子。
5. 對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用。
針對(duì)第五個(gè)原因，我們來(lái)重點(diǎn)談?wù)?。有一些?xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來(lái)終止的消化作用。
我司技術(shù)員分析，這是因?yàn)橐呀?jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。血清蛋白形成了的粘度可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時(shí)，粘度起到重要作用。還含有一些微量元素和離子，他們?cè)诖x解毒中起重要作用。
特別說(shuō)明到了有多位老師提出問(wèn)題：人血清一定要加熱滅活嗎？不然會(huì)怎樣？其實(shí)對(duì)于它的加熱滅活是應(yīng)該根據(jù)情況而定的。
很多朋友在使用實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為一定需要加熱滅活，其實(shí)這個(gè)認(rèn)知是不正確的，是否需要滅活是要根據(jù)情況而定。人們通常通過(guò)在56℃加熱30分鐘的辦法，來(lái)滅活其中的補(bǔ)體，以及其中可能的微生物（比如支原體）的污染。
加熱滅活帶來(lái)的問(wèn)題是，其中的氨基酸、維生素和生長(zhǎng)因子等也會(huì)不同程度的被破壞。
但是它的補(bǔ)體含量很低，即使在未稀釋的胎牛血清中，也觀察不到溶血現(xiàn)象。另外37℃的加熱能夠有效滅活補(bǔ)體。所以對(duì)它而言，并不需要通過(guò)專(zhuān)門(mén)的熱滅活來(lái)滅活其中的補(bǔ)體。
早期的人血清制備中的濾膜的孔徑大于0.22um，不能有效的去除支原體的污染。熱滅活可以去除支原體的污染。但是現(xiàn)在制備中的終端濾膜的孔徑為0.1um甚至小到0.04um，所以一般沒(méi)有支原體的污染。
通過(guò)以上，我們公司總結(jié)：除非有特別的情況，標(biāo)準(zhǔn)廠家生產(chǎn)的一般不需要加熱滅活。不過(guò)因考慮到其質(zhì)量問(wèn)題，為安全起見(jiàn)，還是以加熱滅活為好。