ELISA實驗做不好？篤瑪為您匯總了以下問題

ELISA（免疫酶聯(lián)吸附實驗）是免疫學(xué)基礎(chǔ)實驗之一，大部分生命科學(xué)領(lǐng)域的科研工作者對其都不陌生。因為其特異性強，靈敏度高，可精確定量的特性，在基礎(chǔ)科研和臨床診斷中，ELISA技術(shù)都應(yīng)用廣泛，相信很多關(guān)注我們的小伙伴也都做過ELISA。

Q: ELISA可以檢測胞內(nèi)蛋白么？

A: 可以的，大部分ELISA指標(biāo)均為炎癥因子、趨化因子等分泌類型蛋白，支持的樣本類型也多為血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清等液體樣本。如需檢測胞內(nèi)蛋白，首先需要確認(rèn)待測指標(biāo)是否在胞內(nèi)表達(dá)，然后選用支持組織勻漿樣本的ELISA試劑盒即可，將組織樣品或細(xì)胞樣品進(jìn)行裂解，提取胞內(nèi)蛋白后進(jìn)行蛋白定量，保證每孔上樣總蛋白量一致即可。

Q: ELISA可以測DNA的表觀么？

A: 不可以，ELISA是利用免疫學(xué)原理，定量檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的技術(shù)。測DNA表觀遺傳學(xué)，主要是檢測DNA甲基化，可以選用ChIP技術(shù)。

Q: 夾心法ELISA實驗中的捕獲抗體和檢測抗體是同一個抗體么？

A: 不是的，在雙抗夾心法ELISA實驗中，會同時用到捕獲抗體和檢測抗體，這兩個抗體是針對同一抗原蛋白的不同抗原位點的兩種抗體，這樣才可以同時結(jié)合抗原分子。這也是雙抗夾心法ELISA不適用與小分子抗原和半抗原等待測指標(biāo)的原因。

Q: 試劑盒里面有捕獲抗體么？

A: 即用型ELISA試劑盒中，捕獲抗體已經(jīng)預(yù)包被至試劑盒中的ELISA板上，沒有單獨的捕獲抗體提供，直接使用ELISA板孵育稀釋后的樣本及標(biāo)準(zhǔn)品即可。非即用型的ELISA試劑盒會有捕獲抗體提供，需按照說明書推薦的工作濃度，用稀釋液稀釋后自行包被。

Q: 捕獲抗體如何包被在96孔板上？

A: 如果選用的是即用型ELISA試劑盒，無需進(jìn)行抗體包被，因為試劑盒中的檢測抗體已經(jīng)事先包被在檢測板中；如果是非即用型的ELISA試劑盒，需要自己在實驗前提前進(jìn)行抗體包被，簡要步驟入下：首先，要選擇ELIS別的板子，材質(zhì)應(yīng)為聚苯乙烯；然后用抗體包被液將捕獲抗體稀釋（pH9.6的碳酸鹽緩沖液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作濃度，再每孔加100 μl（96孔板加樣量）稀釋后的捕獲抗體，室溫或4℃過夜包被，然后進(jìn)行洗板和封閉之后再次洗板即可使用，如需長期保存，則需要真空凍干后保存。

Q: ELISA實驗中，酶標(biāo)抗體是什么抗體？識別的目標(biāo)又是什么？

A: 這個問題需要具體分析，在直接法ELISA中，酶標(biāo)抗體直接識別抗原，即可檢測，但缺少二抗放大，且靈敏性不高。在間接法ELISA中，酶標(biāo)抗體作為二抗，識別檢測抗體。而在目前應(yīng)用的雙抗夾心法ELISA中，酶標(biāo)抗體識別的也是檢測抗體，對檢測抗體進(jìn)行識別和酶標(biāo)記。

Q: 試劑盒有推薦樣本稀釋濃度還需要自己測嗎？

A: 試劑盒一般會給出不同樣品類型的的推薦稀釋比例，但是為大致范圍，最好還是根據(jù)自己的樣本情況，設(shè)計預(yù)實驗測量計算。尤其是待測蛋白為炎癥因子時，因為在不同組別樣本間差異巨大，更是需要預(yù)實驗檢測后稀釋。

Q: 做實驗前怎么知道待測血清中炎癥因子的范圍呢？多大是高多小是低？

A: 需要根據(jù)文獻(xiàn)推測，一般在健康人樣本中，炎癥因子表達(dá)很低，接近ELISA檢測下限，樣品無需稀釋或1:1稀釋即可，如已知為炎癥疾病或造模樣本，可參考文獻(xiàn)，在預(yù)實驗中設(shè)置1:10-100（或更高）的稀釋比例，預(yù)實驗檢測后確定最佳濃度進(jìn)行正式實驗。

Q: ELISA實驗中，檢測計算抗原的濃度，臨界值怎么確定？

A: 根據(jù)曲線測定的濃度，建議落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間位置較好，極限最好不要超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的上下限，如果超出較多，會影響計算結(jié)果準(zhǔn)確性，建議調(diào)整稀釋比例。

Q: 配好的抗體沒用完如何保存，可保存多久？預(yù)實驗用了一個試劑盒里面的部分板子和試劑，剩下的板子和試劑還能繼續(xù)用于正式實驗嗎？

A: 針對愛必信的ELISA試劑盒來講，在說明書中有各組分拆開后的保質(zhì)期，配好的母液和拆封的板子，可以在四度保存，保質(zhì)期為一個月左右。剩下的板子和試劑在保質(zhì)期內(nèi)是可以繼續(xù)用于正式實驗的，為保證實驗質(zhì)量，還是建議間隔時間不要太長，一周之內(nèi)更好，需注意試劑避免污染，板子保持干燥。