ELISA實(shí)驗(yàn)中會(huì)遇到的情況

Q：in vivo實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，不太好做預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)ELISA結(jié)果會(huì)有影響么？怎么辦？

A：如果您實(shí)驗(yàn)室之前建立的in vivo實(shí)驗(yàn)protocol經(jīng)過驗(yàn)證，可以保證有效性，那么，可以不用再進(jìn)行相關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn)；并且，如果實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，樣本獲取不易，同時(shí)又需要檢測(cè)較多指標(biāo)，建議將樣品分裝凍存，避免反復(fù)凍融。ELISA實(shí)驗(yàn)還是建議進(jìn)行一下預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸清楚樣本的最佳稀釋比例，取得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Q：檢測(cè)樣本是細(xì)胞培養(yǎng)上清，那么細(xì)胞數(shù)目對(duì)炎癥因子的濃度有影響嗎？

A：有影響，所以不同樣本可以比較的前提條件是培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)水平接近一致。因不同處理，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生產(chǎn)狀態(tài)不同，要保證在鋪板時(shí)接種細(xì)胞數(shù)量水平一致。

Q：打開試劑盒，發(fā)現(xiàn)wash buffer析出結(jié)晶，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響么？怎么辦？

A：wash buffer為高濃度鹽溶液，在低溫保存條件下，有可能出現(xiàn)結(jié)晶析出，為正?，F(xiàn)象，可以放在37℃或55℃烘箱中，析出的結(jié)晶會(huì)溶解，溶解后可正常使用。不可以在結(jié)晶存在的情況下配置wash buffer。

Q：篤瑪生物的ELISA試劑盒顯色液是雙組份的，有些其他品牌的是單組分的，使用單組分的有影響么？

A：HRP酶標(biāo)二抗的ELISA試劑盒，顯色底物一般為TMB，TMB不穩(wěn)定，曝光或污染氧化后會(huì)出現(xiàn)顯色反應(yīng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)背景升高，或無法使用，所以篤瑪生物的ELISA試劑盒將顯色液調(diào)整為雙組份，方便穩(wěn)定保存，僅在使用前混合，避免了TMB的不穩(wěn)定影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液，在使用前檢測(cè)是否為無色透明，如果是正常的，對(duì)結(jié)果也沒有影響，可以放心使用。

Q：同一樣品多次ELISA檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果差異大怎么解決？

A：應(yīng)考慮的問題包括：

樣本保存不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差較大，樣本應(yīng)盡量減少反復(fù)凍融，如需多次檢測(cè)，需在取樣后分裝保存；

樣品凍融之后未混勻，應(yīng)混勻后再上樣；

加樣準(zhǔn)確，微量樣品加樣時(shí)要注意移液器槍頭不要有殘留。

Q：副孔差別比較大，是沒洗干凈嗎？

A：復(fù)孔值差異較大，主要原因應(yīng)考慮加樣是否準(zhǔn)確，洗板過程中是否有殘留以及是否有交叉污染。加樣應(yīng)注意移液器量程，以及槍頭殘留問題；洗板過程應(yīng)注意不要有殘留液體，需要進(jìn)行拍干操作；孵育過程要更換封板膜，拍干過程要換吸水紙，避免交叉污染。

Q：加完終止液之后測(cè)的幾次數(shù)據(jù)差別也蠻大，是什么原因？

A：加完終止液后，顯色反應(yīng)也不是永遠(yuǎn)停止，形成的黃色顏色會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)繼續(xù)加深，建議在15 min內(nèi)讀數(shù)。

Q：整個(gè)過程需要避光嗎？避光需要避到什么程度呢

A：ELISA實(shí)驗(yàn)中，在酶標(biāo)抗體孵育，以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無需避光。避光可采用錫紙包裹，或?qū)⒄麄€(gè)ELISA板子放入暗盒或抽屜等無光處即可。

Q：封板膜什么時(shí)候用？每次加液后都要換嗎？

A：封板膜在孵育樣品、檢測(cè)抗體以及HRP酶標(biāo)抗體時(shí)，都要蓋好封板膜，減少揮發(fā)及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。

Q：ELISA實(shí)驗(yàn)中的洗板步驟如果沒有洗板機(jī)，需要如何操作？

A：實(shí)驗(yàn)室ELISA實(shí)驗(yàn)做的較多，還是建議使用洗板機(jī)洗板，效果更好，也更方便控制。如果沒有洗板機(jī)，在洗板過程中，需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出，在加洗板液后，靜置1-2min，甩干液體后，在吸水紙上大力拍干；重復(fù)三次。

Q：手動(dòng)洗板過程中，拍過抗體或抗原的濾紙需要扔嗎？

A：是需要更換的，防止造成交叉污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Q：ELISA實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)計(jì)算抗原的濃度，臨界值怎么確定？

A：根據(jù)曲線測(cè)定的濃度，建議落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間位置較好，極限最好不要超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的上下限，如果超出較多，會(huì)影響計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確性，建議調(diào)整稀釋比例。

Q：因?yàn)闄z測(cè)限的原因，同一塊ELISA板子，樣本稀釋比例不同，部分樣本1:10稀釋，部分1:20稀釋，這樣設(shè)置可行嗎？結(jié)果可以比較嗎？

A：可以比較，不同稀釋比例，是因?yàn)椴煌瑯颖鹃g的表達(dá)差異較大，只要保證稀釋后的檢測(cè)樣品測(cè)量值準(zhǔn)確，還原回稀釋倍數(shù)后的濃度是可信的?？梢杂脕肀容^不同樣本的原始濃度差。

Q：測(cè)得的值都低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的值，是什么原因，應(yīng)該怎么解決？

A：這種情況需要設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照組來排查，建議在實(shí)驗(yàn)組別設(shè)置中添加陽性對(duì)照孔，用明確表達(dá)的樣品作為陽性對(duì)照，如果標(biāo)準(zhǔn)曲線及陽性樣品均可測(cè)得正常的表達(dá)濃度，則表明實(shí)驗(yàn)成功，檢查其他待測(cè)樣品是否稀釋倍數(shù)過高，可以降低稀釋比，直至直接加樣本原液，如還檢測(cè)不出，則表明該指標(biāo)在其余待測(cè)樣品表達(dá)含量低于檢測(cè)下限，按照0計(jì)算即可。這種情況尤其對(duì)于炎癥因子較為常見，在健康樣本中，表達(dá)含量極低。

Q：標(biāo)準(zhǔn)曲線在推薦的濃度下，r2值為0.9，做了多次都是這樣，怎么辦？

A：這種情況首先要仔細(xì)核對(duì)產(chǎn)品說明書，看是否用了推薦的擬合方法，如篤瑪生物的ELISA試劑盒，需要使用四參數(shù)擬合方式進(jìn)行擬合，用錯(cuò)擬合方式，會(huì)導(dǎo)致r2值較低；如擬合方式無誤，需檢查是否有個(gè)別標(biāo)曲孔數(shù)值異常，排查實(shí)驗(yàn)過程中是否出現(xiàn)污染或標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋時(shí)出現(xiàn)失誤，導(dǎo)致加樣不準(zhǔn)。

Q：試劑盒推薦用450和570nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)，但條件有限可否換成450和620的雙波長(zhǎng)？如何使用校準(zhǔn)波長(zhǎng)？還有，用空白孔校準(zhǔn)可以么？

A：可以的，TMB底物顯色后，吸光峰值在450nm，另外的校準(zhǔn)波長(zhǎng)是防止氣泡等雜質(zhì)造成的干擾設(shè)置，避開450左右50nm以上即可。兩次讀取的OD值，用OD450 - OD校準(zhǔn)波長(zhǎng)即可。盡量還是建議有條件的選用雙波長(zhǎng)校準(zhǔn)的方法，因?yàn)楸苊饬瞬煌椎淖x數(shù)影響，防止出現(xiàn)空白孔污染，導(dǎo)致讀數(shù)較高，無法校準(zhǔn)的情況。

Q：樣本總是在標(biāo)準(zhǔn)曲線之外，稀釋100倍也是，怎么辦？

A：在設(shè)置稀釋倍數(shù)之前，需要參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)于一些表達(dá)的蛋白，確實(shí)會(huì)出現(xiàn)這種情況，之前小編接到過的案例，樣品需要稀釋10000倍，目的蛋白才落在檢測(cè)區(qū)間內(nèi)。建議繼續(xù)提高稀釋比例。

Q：最后顯示的OD值在多少之間屬于可用值，有要求嗎？

A：有的，建議標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)的OD值在2.0左右較好，也可參考說明書標(biāo)曲的數(shù)據(jù)。